الأنيلين 4-hydroxylase ( آه )طقم اختبار النشاط

طريقة تتبع 100 أنبوبص عينة

يجب أن تؤخذ قبل التصميم الرسمي 2-3 توقعات الطقس من عينة كبيرة مع توقع الفرق .تحديد المعنى :

سيتوكرومP450 الإنزيمات هي مجموعة من الإنزيمات التي توجد أساسا في الكبد و تلعب دورا هاما في استقلاب المواد الأجنبية ، ولا سيما المخدراتالسموم الأيض .آه فيP450 في نظام الإنزيمCYP2E1 السلالةCYP2E1 ليس فقط المشاركة في استقلاب المخدرات ، ولكن أيضا تحفيزتفعيل procarcinogens و protoxins . . . . . . .

مبدأ القياس :

آه الحفاز الأنيلين الهيدروكسيل 4أمينوفينول ، مزيد من التحول إلى الفينول-إندول معقدة 630 نانومتر هناك خاصية امتصاص الذروة . تمرأكثر من قياس 630 نانومترزيادة معدل الامتصاصآهنشط .

طقم اختبار النشاط ( 4-hydroxylase الأنيلين آه )

تكوين

كاشف واحد : مسحوقس قارورة4℃حفظ . قبل الانضمام 100 مل الماء المقطر يذوب تماما . الكاشف الثالث : مسحوقسقارورة4℃حفظ . قبل الانضمام 10 ملالماء المقطر يذوب تماما . كاشف أربعة : مسحوقسقارورة4℃حفظ . قبل الانضمام 5 ملالماء المقطر يذوب تماما .

كاشف ستة : مسحوقس قارورة ( الكاشف للتآكل ) ،4℃تجنب الضوء حفظ . قبل الانضمام 10 مل الماء المقطر يذوب تماما . كاشف سبعة : مسحوقسقارورة4℃حفظ . قبل الانضمام 10 ملالماء المقطر يذوب تماما .

مستوى السائل : سائلس قارورة10 ميكرومول / لترو4℃تجنب الضوء حفظ .

معايير محددة من المنتجات تخضع المعايير الواردة في مواصفات المنتج

المعدات واللوازم :

العام الطرد المركزي ، الطرد المركزي السرعة الزائدة ، مرئية طيفيوenzymic جهاز قياس الألوان ، تتبع الزجاج طبقس فتحة لوحة مزدوجة تبخير المياه والجليد .

استخراج انزيم الخام :

1、إزالة نواة الميتوكوندريا وغيرها من المواد الجزيئية :دعوة حول 0.5g الانضمام إلى منظمة 1 مل كاشف واحد ، وطحن تماما على الجليد ،10 000g 4℃，طرد مركزي 30 دقيقةإزالة طاف ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي .

2、الميكروسومي الخشن 100 000g 4℃الطرد المركزي 60 دقيقةتجاهل طاف .

3、إزالة الشوائب مثل الهيموجلوبين :نحو خطوة 2 إضافة إلى هطول الأمطار 1 مل كاشف واحد ، بعد تغطية مغلقة تماما يهز حل ،100 000g طرد مركزي 30 دقيقةمهجور

طاف .

4、الميكروسومي النهائينحو خطوة 3 إضافة الكاشف الثاني 0.5 ملبعد تغطية مغلقة تماما يهز حل ، وهذا هو ، الخام انزيم السائل ، في انتظار الاختبار .

تحديد العمليةس

1. طيفيوجهاز التسخين 30 دقيقةضبط الطول الموجي 630 نانومترالماء المقطر .

2. كاشف ثلاثة 37℃التسخين في حمام مائي 30 دقيقةمنتدى

3. كاشف خمسة قبل التبريد في حمام الثلج 30 دقيقةمنتدى

4. أنبوب القياسية :取 0.5 مل إيب أنبوب 100 ميكرولتر السائل القياسية ،100 ميكرولتر كاشف ستة100 ميكرولتر كاشف 7 ، بعد خلط في درجة حرارة الغرفة 30 دقيقة，امتص 200 ميكرولترتتبع الزجاج طبق اللونيةسثقب لوحة ،630 نانومترقياس امتصاص الضوءAأنبوب القياسية .

5. الرعاية取 0.5 مل إيب أنبوب 50 ميكرولتر انزيم السائل الخام ،100 ميكرولتر الكاشف الثالث50 ميكرولتر الماء المقطر بعد الاختلاط 37℃العزل الحراري في حمام مائي 30 دقيقةن

إضافة مرة أخرى 100 ميكرولتر كاشف 5 ، بعد خلط حمام الثلج 5 دقايقو11000 دورة في الدقيقةو4℃الطرد المركزي 10 دقايق；取 100 ميكرولتر طاف ، إضافة جديدة 0.5 ملإيب أنابيب ; إضافة مرة أخرى 100 ميكرولتر كاشف ستة100 ميكرولتر كاشف 7 ، بعد خلط في درجة حرارة الغرفة 30 دقيقةمص 200 ميكرولتر تتبع الزجاج طبق اللونيةس ثقبلوحات630 نانومترقياس امتصاص الضوء Aالرعاية .

6. تحديد أنبوب :取 0.5 مل إيب أنبوب 50 ميكرولتر انزيم السائل الخام ،100 ميكرولتر الكاشف الثالث50 ميكرولتر كاشف أربعة ، بعد خلط 37℃العزل الحراري في حمام مائي 30 دقيقةن

إضافة مرة أخرى 100 ميكرولتر كاشف 5 ، بعد خلط حمام الثلج 5 دقايقو11000 دورة في الدقيقةو4℃الطرد المركزي 10 دقايق；取 100 ميكرولتر طاف ، إضافة جديدة 0.5 ملإيب أنابيب ; إضافة مرة أخرى 100 ميكرولتر كاشف ستة100 ميكرولتر كاشف 7 ، بعد خلط في درجة حرارة الغرفة 30 دقيقةمص 200 ميكرولتر تتبع الزجاج طبق اللونيةس ثقبلوحات630 نانومترقياس امتصاص الضوء Aتحديد أنبوب .

آه صيغة حساب النشاطس

أ.الصيغة الحسابية لتحديد أثر الكوارتز اللونية طبق على النحو التالي

（1）حسب تركيز البروتين

تعريف الوحدة النشطة :37℃كل ملليغرام من البروتين في الدقيقة 1nmol 4أمينوفينول 1 نشاط انزيم وحدة .

آه نشط(nmol / دقيقة / ملغ بروتسC معيار المنتج× V معيار المنتجس( أ )A تحديد أنبوبA العناية المركزة (÷أ أنبوب القياسيةستخفيف متعددةم( أ )Cpr × Vعينة (÷T

سس( أ )A تحديد أنبوبA العناية المركزة (÷أ أنبوب القياسية÷Cprمنتدى

（2）حسب نوعية العينة

تعريف الوحدة النشطة :37℃الحفز في الدقيقة لكل غرام من العينات 1nmol 4أمينوفينول 1 نشاط انزيم وحدة .

آهنشط(nmol / دقيقة / غرام الوزن الطازجسC معيار المنتج× V معيار المنتجس( أ )A تحديد أنبوبA رعايةومA أنبوب القياسيةستخفيف متعددة÷ (W × V) عينة÷T

سس( أ )A تحديد أنبوبA العناية المركزة (÷أ أنبوب القياسية÷W

Cالمنتجات القياسية :10 ميكرومول / لترنVالمنتجات القياسية :100 ميكرولتر = 1 × 10^-4Lتخفيف مضاعفات : Vعكس مجموع÷Vطاف= 300 ميكرول ÷ 100 ميكرول = 3نسي بي آرخشنتركيز بروتين سائل الإنزيم )ملغ / ملوتحتاج إلى مزيد من التصميم ، اقترح استخدام الشركة BCA أدوات تحديد محتوى البروتين .W : عينة نوعية ;Vعينة : إضافة حجم الخام حل بالإنزيم في نظام رد الفعل ، 50 ميكرولتر = 0.05 ملن Tزمن رد الفعل الحفاز )دقيقةو30 دقيقةمنتدى

ب.استخدام 96 الصيغة الحسابية لتحديد فتحة لوحة على النحو التالي

（1）حسب تركيز البروتين

تعريف الوحدة النشطة :37℃كل ملليغرام من البروتين في الدقيقة 1nmol 4أمينوفينول 1 نشاط انزيم وحدة .

آه نشط(nmol / دقيقة / ملغ بروتسC معيار المنتج× V معيار المنتجس( أ )A تحديد أنبوبA العناية المركزة (÷أ أنبوب القياسيةستخفيف متعددةم( أ )Cpr × Vعينة (÷T

سس( أ )A تحديد أنبوبA العناية المركزة (÷أ أنبوب القياسية÷Cpr

（2）حسب نوعية العينة

تعريف الوحدة النشطة :37℃الحفز في الدقيقة لكل غرام من العينات 1nmol 4أمينوفينول 1 نشاط انزيم وحدة .

آه نشط(nmol / دقيقة / غرام الوزن الطازجسC معيار المنتج× V معيار المنتجس( أ )A تحديد أنبوبA رعايةومA أنبوب القياسيةستخفيف متعددة÷ (W × V) عينة÷T

سس( أ )A تحديد أنبوبA العناية المركزة (÷أ أنبوب القياسية÷W

C المنتجات القياسية :10 ميكرومول / لترنV المنتجات القياسية :100 ميكرولتر = 1 × 10^-4Lتخفيف مضاعفات :V عكس مجموع÷Vطاف= 300 ميكرول ÷ 100 ميكرول = 3نسي بي آرتركيز البروتين في حل بالإنزيم الخام )ملغ / ملوتحتاج إلى مزيد من التصميم ، اقترح استخدام الشركة BCA أدوات تحديد محتوى البروتين . W : عينة نوعية ; Vعينة : إضافة حجم الخام حل بالإنزيم في نظام رد الفعل ، 50 ميكرولتر = 0.05 ملن Tزمن رد الفعل الحفاز )دقيقةو30 دقيقةمنتدى

طقم اختبار النشاط ( 4-hydroxylase الأنيلين آه )