أمينوبيرين-نdemethylase )ووطقم اختبار النشاط

طريقة تتبع 100 أنبوبص عينة

يجب أن تؤخذ قبل التصميم الرسمي 2-3 توقعات الطقس من عينة كبيرة مع توقع الفرق .تحديد المعنى :

سيتوكرومP450 الإنزيمات هي مجموعة من الإنزيمات التي تلعب دورا هاما في عملية التمثيل الغذائي من المواد الأجنبية ، ولا سيما الأدوية والسموم .و كـP450عضو مهم في نظام الإنزيمCYP3A4 السلالة التي ترتبط ارتباطا وثيقا demethylation المخدرات .

مبدأ القياس :

و الفورمالديهايد من خلال تحفيز aminobilin الإصدار ناش تحديد محتوى الفورمالديهايد اللونيةخارج و نشط .

n-demethylase-n-aminobilin-n-demethylase إليسا كيت

تكوين

كاشف واحد : مسحوقس قارورة4℃حفظ . قبل إضافة 100 مل الماء المقطر يذوب تماما .

الكاشف الثالث : مسحوقس أنابيب4℃تجنب الضوء حفظ . قبل الانضمام 1 مل الإيثانول المطلق ، حل تماما . كاشف أربعة : مسحوقسأنابيب4℃حفظ . قبل الانضمام 0.5 ملالماء المقطر يذوب تماما .

الكاشف الخامس : مسحوقس زجاجة ، والحفاظ على درجة حرارة الغرفة . إضافة الماء المقطر قبل الاستخدام 4 مل حل تماما .

مستوى السائل : سائلس قارورة-20℃حفظ . قبل استخدام 1.5 مل إيب أنبوب 10 ميكرولتر السائل القياسية ، بالإضافة إلى 990 ميكرولتر الماء المقطر0.05 ممول / لتر معيار جيا ألدهيد الحل ،4℃حفظ .

معايير محددة من المنتجات تخضع المعايير الواردة في مواصفات المنتج

المعدات واللوازم :

العام الطرد المركزي ، الطرد المركزي السرعة الزائدة ، حمام الماء عموم ، قابل للتعديل بندقية ماصة ، الأشعة فوق البنفسجية الإجاروenzymic جهاز قياس الألوان ، تتبع الكوارتز طبقس ثقبلوحة ، الماء المقطر ، اللامائية الكحول والجليد .

استخراج الخام انزيمس

1、إزالة نواة الميتوكوندريا وغيرها من المواد الجزيئية :دعوة حول 0.5g الانضمام إلى منظمة 1 مل كاشف واحد ، وطحن تماما على الجليد ،10 000g 4℃بعيداقلب . 30 دقيقةإزالة طاف في أنبوب الطرد المركزي .

2、الميكروسومي الخشن4℃و100 000gالطرد المركزي 60 دقيقةتجاهل طاف .

3إزالة الشوائب مثل الهيموغلوبين 2 إضافة إلى هطول الأمطار 1 مل كاشف واحد ، بعد تغطية مغلقة تماما يهز حل ،100 000g طرد مركزي 30 دقيقةمهجورطاف .

4、الميكروسومي النهائينحو خطوة 3 إضافة الكاشف الثاني 0.5 ملبعد تغطية مغلقة تماما يهز حل ، وهذا هو ، الخام انزيم السائل ، في انتظار الاختبار . السائل يحتاج إلى اختبار

استخدام اليوم .

و عملية تحديد النشاط :

1. طيفيوجهاز التسخين 30 دقيقةضبط الطول الموجي 412 نانومترالماء المقطر .

2. الكاشف الثاني 37℃التسخين في حمام مائي 30 دقيقةمنتدى

3. الرعاية取 1 رامي .إيب أنبوب 10 ميكرولتر انزيم السائل الخام ،170 ميكرولتر الكاشف الثاني10 ميكرولتر الكاشف الثالث10 ميكرولتر الماء المقطر ، مختلطة جيدا 37℃

حمام الماء العزل الحراري 30 دقيقةالانضمام فورا 35 ميكرولتر كاشف 5 ، مختلطة جيدا في حمام الثلج 5 دقايق；取خارجبعد إضافة 35 ميكرولتر كاشف 6 ، درجة حرارة الغرفة بعد الاختلاطموقف ثابت 5 دقايقدرجة حرارة الغرفة 8000 دورة في الدقيقة طرد مركزي 5 دقايقجلب جديدةإيب أنبوب 100 ميكرولتر طاف100 ميكرولتر كاشف سبعة ، بعد خلط 60℃حمام مائي 10 دقايقثم تأخذخارج، يبرد بالماء البارد 5 دقايقفي 412 نانومترقياس امتصاص الضوءAالرعاية .

4. تحديد أنبوب :取 1 رامي .إيب أنبوب 10 ميكرولتر انزيم السائل الخام ،170 ميكرولتر الكاشف الثاني10 ميكرولتر الكاشف الثالث10 ميكرولتر الكاشف الرابع ، بعد خلط 37℃

حمام الماء العزل الحراري 30 دقيقةالانضمام فورا 35 ميكرولتر كاشف 5 ، مختلطة جيدا في حمام الثلج 5 دقايق；取خارجبعد إضافة 35 ميكرولتر كاشف 6 ، درجة حرارة الغرفة بعد الاختلاطموقف ثابت 5 دقايقدرجة حرارة الغرفة 8000 دورة في الدقيقة طرد مركزي 5 دقايق；取 1 رامي جديدإيب أنبوب 100 ميكرولتر طاف100 ميكرولتر كاشف سبعة ، بعد خلط 60℃ماءحمام . 10 دقايقثم تأخذخارج، يبرد بالماء البارد 5 دقايقفي 412 نانومترقياس امتصاص الضوءAتحديد أنبوب .

5. أنبوب القياسية :取 1 رامي .إيب أنبوب 100 ميكرولتر السلع القياسية ،100 ميكرولتر كاشف سبعة ، بعد خلط 60℃حمام مائي 10 دقايقثم تأخذخارجمع البردتبريد المياه5 دقايقفي412 نانومتر قياس امتصاص الضوءA أنبوب القياسية .

ملاحظة : كل عينة تحتاج إلى عناية .

و حساب النشاط

أ.الصيغة الحسابية لتحديد أثر الكوارتز اللونية طبق على النحو التالي

（1）حسب تركيز البروتين

تعريف الوحدة النشطة :37℃إنتاج البروتين المحفز في ملليغرام في الدقيقة 1nmol الفورمالديهايد 1 نشاط انزيم وحدة .

و نشط(nmol / دقيقة / ملغ بروتسC معيار المنتجسV معيار المنتجس( أ )A تحديد أنبوبA رعايةومA أنبوب القياسيةستخفيف متعددةم( أ )Cpr× Vعينة (÷T

سس( أ )A تحديد أنبوبA العناية المركزة (÷أ أنبوب القياسية÷Cprمنتدى

（2）حسب نوعية العينة

تعريف الوحدة النشطة :37℃في الدقيقة لكل غرام من الأنسجة المنتجة بشكل حفاز 1nmol الفورمالديهايد 1 نشاط انزيم وحدة .

و نشط(nmol / دقيقة / غرام الوزن الطازج سC معيار المنتج× V معيار المنتجس( أ )A تحديد أنبوبA العناية المركزة (÷أ أنبوب القياسيةستخفيف متعددة÷(V) عينة

÷V مجموع العينة× W) ÷T

سس( أ )A تحديد أنبوبA العناية المركزة (÷أ أنبوب القياسية÷Wمنتدى

C المنتجات القياسية :0.05 ممول / لتر = 50 ميكرومول / لترنV المنتجات القياسية :500 ميكرولتر = 0.0005 Lتخفيف مضاعفات :V عكس مجموع÷V طافس（50 + 850

50 + 50 + 175 + 175و• ÷ 500 = 2.7نسي بي آرتركيز البروتين في حل بالإنزيم الخام )ملغ / ملوتحتاج إلى مزيد من التصميم ، اقترح استخدام الشركة BCAأدوات تحديد محتوى البروتين .Vعينة : إضافة حجم انزيم الخام ،50 ميكرولتر = 0.05 ملنVمجموع العينة : استخراج حجم ،0.5 ملنTزمن رد الفعل الحفاز )دقيقةو30 دقيقةمنتدى

ب.استخدام 96 الصيغة الحسابية لتحديد فتحة لوحة على النحو التالي

（1）حسب تركيز البروتين

تعريف الوحدة النشطة :37℃إنتاج البروتين المحفز في ملليغرام في الدقيقة 1nmol الفورمالديهايد 1 نشاط انزيم وحدة .

و نشط(nmol / دقيقة / ملغ بروتسC معيار المنتج× V معيار المنتجس( أ )A تحديد أنبوبA رعايةومA أنبوب القياسيةستخفيف متعددةم( أ )Cpr× Vعينة (÷T

سس( أ )A تحديد أنبوبA العناية المركزة (مA أنبوب القياسيةمسي بي آرمنتدى

（2）حسب نوعية العينة

تعريف الوحدة النشطة :37℃في الدقيقة لكل غرام من الأنسجة المنتجة بشكل حفاز 1nmol الفورمالديهايد 1 نشاط انزيم وحدة .

و نشط(nmol / دقيقة / غرام الوزن الطازجسC معيار المنتج× V معيار المنتجس( أ )A تحديد أنبوبA العناية المركزة (÷أ أنبوب القياسيةستخفيف متعددة÷(V) عينة÷Vمجموع العينة× W) ÷T

سس( أ )A تحديد أنبوبA العناية المركزة (مA أنبوب القياسية÷Wمنتدى

C المنتجات القياسية :0.05 ممول / لتر = 50 ميكرومول / لترنV المنتجات القياسية :500 ميكرولتر = 0.0005 Lتخفيف مضاعفات :V عكس مجموع÷V طافس（50 + 850

50 + 50 + 175 + 175و• ÷ 500 = 2.7نسي بي آرتركيز البروتين في حل بالإنزيم الخام )ملغ / ملوتحتاج إلى مزيد من التصميم ، اقترح استخدام الشركة BCAأدوات تحديد محتوى البروتين .V عينة : إضافة حجم انزيم الخام ،50 ميكرولتر = 0.05 ملنV مجموع العينة : استخراج حجم ،0.5 ملنTزمن رد الفعل الحفاز )دقيقةو30 دقيقةمنتدى

ملاحظة :

1الخام انزيم الحل يجب أن تكتمل في نفس اليوم ، إذا كان يحتاج إلى الحفاظ على استخراج الخام انزيم الحل 3 إضافة إلى هطول الأمطار 0.5 مل 20%الجلسرين ، بعد التعبئة ،

-80℃حفظ

2الكواشف والكواشف الثالث والرابع يجب أن تكون جاهزة للاستخدام الفوري ، إذا لم تستخدم في ذلك اليوم ،4℃تجنب الضوء حفظ المتاحة 1 أسبوع

3الخام انزيم يمكن استخدامها مباشرة في تحديد تركيز البروتين . BCA محتوى البروتين تم قياسها .

n-demethylase-n-aminobilin-n-demethylase إليسا كيت