التفاعل الجزيئي التجربة : رقاقة لونين immunoprecipitation

أولاً - مقدمة فنية

رقاقة ( لونين immunoprecipitation المشارك ) هي التكنولوجيا الرئيسية لدراسة التفاعل بين البروتين والحمض النووي ، ويستخدم على نطاق واسع في تحديد عوامل النسخ ملزمة المواقع ، تحليل جينية ، وهلم جرا .

ثانياً - المبادئ التقنية

باستخدام مستضد الضد محددة ملزمة ، شظايا الحمض النووي جنبا إلى جنب مع البروتين الهدف عجل ، والتي يمكن أن تعكس حقا تنظيم البروتينات ملزمة تسلسل الحمض النووي .

تطبيق المشهد

1 - تنظيم النسخ : تحديد عوامل النسخ مثلالبروتين p53 ، نف

علم التخلق : تحليل التعديلات هيستونh3k27me3 ) في إسكات الجينات .

3 - آلية المرض : استكشاف أنماط الجينوم ملزمة البروتينات الشاذة ( مثل myc ) في السرطان .

4 - يجوزqpcr seq , وغيرها من التكنولوجيات المستخدمة معا .

رابعاً - المزايا التقنية

رقاقة يمكن التقاط دينامية ملزمة البروتين والحمض النووي في حالة حقيقية من خلال ربط الفورمالديهايد ، وتجنب السلبية الكاذبة أو الإيجابية الكاذبة في المختبر .في حينالأجسام المضادة المحددةودقة تخصيب الحمض النووي شظايا ملزمة البروتين المستهدف ، جنبا إلى جنب مع qpcr أو تسلسل ( رقاقة بعدها ) لتحقيق انخفاض مستوى 1000 خلية الكشف ( على سبيل المثال ، الأمثل كيت ) ، حساسية كبيرةفائدة نموذج يحتوي على مزايا تطبيق واسع النطاق .

نوع العينة

الخلايا الطازجة ( خلايا ملتصقة / تعليق الخلايا ) ، الخلايا المجمدة ، المجمدة الأنسجة ، عبر ربط عينات من الخلايا .

عينة الطلب

عينات من الخلايا : حوالي 1 × 10 ^ 7 ( يمكن أن يكون 10 سم طبق ، أو تعليق الخلايا المخزنة في أنبوب الطرد المركزي ، أو 1 زجاجة T75 ) ؛

الأنسجة المجمدة : حوالي 70 ملغ .

crosslinked عينة الخلية : 1 ٪ الفورمالديهايد crosslinked استخدمت لعلاج الخلايا .

إعداد العينات والنقل

الخلايا الحية : عينات من الخلايا الطازجة التي أثيرت في أطباق / t75 زجاجات / أنابيب الطرد المركزي يمكن نقلها عن طريق البريد السريع في درجة الحرارة العادية ( في اليوم التالي على الأكثر ) في أقرب وقت ممكن ، يمكن أن يكون فلاش أو تسليمها شخصيا في هذه المدينة ، بعيدا ، يمكن أن يكون - 80 ℃ تجميد الخلايا المجمدة النقل ؛

عينات الأنسجة والخلايا بعد crosslinked : تجميد الجليد الجاف النقل في 80 ℃ . . . . . . .

ثامناً - الكواشف المطلوبة

تم الكشف عن الأجسام المضادة باستخدام رقاقة الصف .

الدورة التجريبية

1-2 أسابيع ( بدون تسلسل )

عاشراً - مسائل أخرى

في وقت لاحق من الكشف عن اختيار RT - PCR ، الكشف عن الموقع يجب أن تكون المقدمة .

خطوات محددة من الفورمالديهايد crosslinked الخلايا هي كما يلي : ① الفورمالديهايد مع التركيز النهائي من 1 ٪ تضاف إلى طبق من الخلايا و حضنت في 37 ℃ لمدة 10 دقائق . ② الباردة dpbs تحتوي على [ 1 ملم pmsf ، 1 ميكروغرام / مل و 1 ميكروغرام / مل pepstatin آپروتينين ) كانت تستخدم لغسل الخلايا مرتين . كشط الخلايا في 2 مل من dpbs الباردة التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني ، ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي ، وتجميد وإرسالها .