تجربة التفاعل الجزيئي : قطع & أمبير؛ العلامة المستهدفة وقطع العلامات

أولاً - مقدمة فنية

قطع العلامة هي حساسة للغاية epigenomic تقنية التحليل القائم على الأجسام المضادة الموجهة نحو استهداف الكروماتين الانقسام ووضع العلامات ، الذي يتغلب على عنق الزجاجة التقليدية رقاقة seq مثل انخفاض الحساسية ، وارتفاع الضوضاء في الخلفية ، وارتفاع الطلب على عينة ، وما إلى ذلك ، يمكن تحليل الكروماتين هيستون تعديل عامل النسخ ملزمة على مستوى خلية واحدة و تصبح جديدةاتجاهمنتدى

ثانياً - المبادئ التقنية

قطع وسم دقة الكروماتين التحليل من خلال أربع خطوات من ردود الفعل الرئيسية :

1 - استهداف الأجسام المضادة :الأجسام المضادة المحددة ( على سبيل المثال ، h3k4me3 الأجسام المضادة ) ربط المنطقة المستهدفة لونين ، protein-a / ز الأجسام المضادة تحمل tn5 ترانسبوزيم المعقدة ( بما في ذلك تسلسل المفاصل ) .

2 - القطع المستهدفة ووضع العلامات :إن tn5 ترانسبوزيم ( tn5 ترانسبوزيم ) تحت إشراف الأجسام المضادة ، الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ( DNA ) أجريت على الهدف لونين و مفرق .

3 - الإفراج عن أجزاء الحمض النووي :البروتيني ك هضم الكروماتين عبر ربط ، والإفراج عن الحمض النووي شظايا مع المفاصل .

4 - بناء المكتبة وتسلسلها :الهدف جزء تضخيمه PCR ، ثم تسلسل مكتبة إيلومينا شيد مع عمق 20 مليون قراءة / عينة ( 50 في المائة أقل من رقاقة seq ) .

تطبيق المشهد

قطع العلامات على مستوى خلية واحدة تكشف عن الاختلافات الجينية بين مختلف الفئات الفرعية في المكروية الورم .

على سبيل المثال :

1 . trinegative سرطان الثدي : foxa1-regulated superمحسن تم تفعيلها على وجه التحديد في subgenotypes القاعدية عن طريق قطع خلية واحدة و العلامات التي تحفز التعبير عن الجينات الرئيسية ( مثل snai1 ) EMT ( الظهارية - الوسيطة التحول ) وتعزيز الانبثاث .

2 - ابيضاض الدم النقوي الحاد ( AML ) : التغيرات الدينامية من h3k4me1 تعديل في CD34 + الخلايا الجذعية تم تحديدها من خلال تتبع عينات من نخاع العظام من المرضى الذين يعانون من الانتكاس .

3 - إعادة برمجة التخلق الظاهر : قطع وسم يمكن أن تتبع عملية دينامية هيستون تعديل في وقت مبكر من التطور الجنيني .

4 - الماوس قبل زرع الأجنة : h3k9me3 بدأت تترسب في 2-cell المرحلة ، ويفضل أن يكون المسمى المنتسخة العكسية ينقول المناطق ( على سبيل المثال ، line-1 ) التي تحافظ على الاستقرار الجيني من خلال تثبيط ينقول النشاط .

5 - الخلايا الجذعية الجنينية البشرية : رسم خريطة ديناميكية h3k27ac في تمايز الخلايا العصبية ، موقع محسن الشبكة التي ينظمها sox2 و oct4 ، وكشف عن مفتاح عقدة خروج متعدد الوظائف .

6 - تنظيم وظيفة الخلايا المناعية : تحليل واضح أساس تمايز الخلايا التائية ووظيفتها .

7 - نضوب الخلايا التائية : في نموذج العدوى الفيروسية المزمنة ، h3k27ac من نضوب الخلايا التائية CD8 + تم العثور على أن تكون غنية بشكل غير طبيعي في pd-1 و tim-3 مواضع هذه محسن النشاط مباشرة ينظمها توكس عامل النسخ .

8 - الخلايا التائية التنظيمية ( Treg ) : جنبا إلى جنب مع atac-seq كشفت أن foxp3 استقرت وظيفة المثبطة Treg الخلايا عن طريق إعادة عرض تعديل h3k4me3 ، التي تعتمد على ezh2 بوساطة h3k27me3 تثبيط التآزر .

رابعاً - المزايا التقنية

1 . حساسية عالية ( 100 خلية اختبار ) : tn5 ترانسبوزيم مباشرة تقطع في الموقع المستهدف و ربط تسلسل الحمض النووي المشتركة ، لتجنب تجزئة ( بالموجات فوق الصوتية ) في رقاقة seq الناجمة عن كلمة خسارة . نسبة الإشارة إلى الضوضاء ( ق / ن = 12 : 1 مقابل 1.5 : 1 ) من قطع العلامة بنسبة 8 مرات مقارنة مع chip-seq ، وعدد من القمم بنسبة 40 في المائة .

2 - قاعدة واحدة القرار وتحديد المواقع بدقة : الأجسام المضادة - tn5 معقدة فقط قطع الحمض النووي بالقرب من موقع ملزم ( ± 50 بي بي ) ، في حين أن رقاقة seq بالموجات فوق الصوتية كسر تنتج 200-500 بي بي كلمة شظايا . في تحليل البروتين p53 ملزمة المواقع ، واحدة ضيقة الذروة ( ذروة العرض ∶ 30 بي بي ) تم الكشف عنها من قبل قطع العلامات ، في حين أن شريحة seq أظهرت ذروة واسعة ( ذروة العرض ∶ 200 بي بي بي ) ، في السابق يمكن أن يقع في مركز ttgcct عزر بدقة .

3 . خلية واحدة و توافق مع الظواهر المكانية : جنبا إلى جنب مع منصة 10 × علم الوراثة ، خلية واحدة و الأجسام المضادة - tn5 المجمعات كانت ملفوفة في قطرات الزيت من خلال microfluidic السيطرة .

4 - وضعت حديثا قطع العلامات المكانية تقنية يمكن استخدامها لتحديد هيكل توزيع h3k4me3 على شرائح الأنسجة ، على سبيل المثال ، تصور نشاط الخلايا العصبية ذات التعديلات في قرن آمون في الفئران شرائح الدماغ .

نوع العينة

الخلايا الطازجة ( الخلايا الملتصقة / تعليق الخلايا ) ، الخلايا المجمدة ، المجمدة الأنسجة .

عينة الطلب

عينات من الخلايا : حوالي 10 ، 000 ( يمكن أن تكون واحدة من 24 لوحة المسام ، أو تعليق الخلايا المخزنة في أنابيب الطرد المركزي ) ؛

الأنسجة المجمدة : حوالي 10-20mg . . . . . . .

إعداد العينات والنقل

عينات من الخلايا الحية : أقرب إلى تقديم عينات جديدة ، مثقف في طبق / أنابيب الطرد المركزي من الخلايا الطازجة في درجة حرارة الغرفة عن طريق البريد السريع ( في موعد أقصاه اليوم التالي ) النقل في المدينة يمكن أن يكون فلاش أو تسليمها شخصيا . المسافة بعيدة نسبيا ، يمكن أن تكون - 80 ℃ تجميد خلية الثلج الجاف النقل ؛

عينات الأنسجة : تجميد وتخزين الجليد الجاف النقل في 80 ℃ . . . . . . .

ثامناً - الكواشف المطلوبة

رقاقة مستوى الأجسام المضادة ( إذا كان مستوى الأجسام المضادة يمكن أن تكون مختارة من دون )

الدورة التجريبية

1-2 أسابيع ( بدون تسلسل )

عاشراً - مسائل أخرى

بعد الكشف عن تسلسل PCR / Rrealtime