التفاعل الجزيئي التجربة : التمزق ( الجيش الملكي النيبالي immunoprecipitation ) .

أولاً - مقدمة فنية

التمزق ( الجيش الملكي النيبالي immunoprecipitation ) التكنولوجيا هي واحدة من أهم الطرق التجريبية لدراسة التفاعل بين الحمض النووي الريبي والبروتين داخل الخلايا ، والتي يمكن أن تكشف عن آلية وظيفية الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات ( RBP ) في التنظيم بعد النسخ .

ثانياً - المبادئ التقنية

مزق يستخدم الأجسام المضادة ضد البروتين الهدف يعجل RNA - البروتين معقدة ، من خلال عزل وتنقية الحمض النووي الريبي ملزمة في مجمع RT-PCR التحقق أو تسلسل التحليل ، والنتيجة هي أكثر بيولوجيا مقنعة .

تطبيق المشهد

1 - الآلية الأساسية : تحليل وظيفة الحمض النووي الريبي ملزمة البروتينات ( مثل ago2 و polycomb المعقدة ) و تنظيم شبكة من الحمض النووي الريبي .

2 - دراسة الأمراض : مقارنة الاختلافات في الحمض النووي الريبي البروتين التفاعلات بين المرض و العينات العادية ، وتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة ( مثل السرطان ذات الصلة lncrna ) .

3 - تطوير المخدرات : تقييم تأثير المخدرات على التفاعل بين الحمض النووي الريبي والبروتين ، وتسريع الهدف الفرز .

رابعاً - المزايا التقنية

حساسية عالية : يمكن الكشف عن ضعف التفاعل بين الحمض النووي الريبي والبروتين مع انخفاض وفرة .

2 - مجموعة ديناميكية : من عدد قليل من الخلايا ( على سبيل المثال ، 5 × 10 ⁷ ) عينات الأنسجة المعقدة تنطبق .

3 - الجمع بين عدة مجموعات من التعلم : الجمع بين الحمض النووي الريبي seq clip-seq , أو chip-seq لبناء شبكة تنظيمية متعددة الأبعاد .

نوع العينة

الخلايا الطازجة ( خلايا ملتصقة / تعليق الخلايا ) ، الخلايا المجمدة ، المجمدة الأنسجة ، عبر ربط عينات من الخلايا .

عينة الطلب

عينات من الخلايا : حوالي 1 × 10 ^ 7 ( يمكن أن يكون 10 سم طبق ، أو تعليق الخلايا المخزنة في أنبوب الطرد المركزي ، أو 1 زجاجة T75 ) ؛

cryopreserved الأنسجة : حوالي 70 ملغ ، crosslinked عينة الخلية : 1 ٪ الفورمالديهايد crosslinked الخلايا .

إعداد العينات والنقل

الخلايا الحية : عينات من الخلايا الطازجة التي أثيرت في أطباق / t75 زجاجات / أنابيب الطرد المركزي يمكن نقلها عن طريق البريد السريع في درجة الحرارة العادية ( في اليوم التالي على الأكثر ) في أقرب وقت ممكن ، يمكن أن يكون فلاش أو تسليمها شخصيا في هذه المدينة ، بعيدا ، يمكن أن يكون - 80 ℃ تجميد الخلايا المجمدة النقل ؛

عينات الأنسجة والخلايا بعد crosslinked : تجميد الجليد الجاف النقل في 80 ℃ . . . . . . .

ثامناً - الكواشف المطلوبة

تم الكشف عن الأجسام المضادة باستخدام رقاقة الصف .

الدورة التجريبية

1-2 أسابيع ( بدون تسلسل )

عاشراً - مسائل أخرى

في وقت لاحق من الكشف عن اختيار RT - PCR ، الكشف عن الموقع يجب أن تكون المقدمة .

خطوات محددة من الفورمالديهايد crosslinked الخلايا هي كما يلي : ① الفورمالديهايد مع التركيز النهائي من 1 ٪ تضاف إلى طبق من الخلايا و حضنت في 37 ℃ لمدة 10 دقائق . ② الباردة dpbs تحتوي على [ 1 ملم pmsf ، 1 ميكروغرام / مل و 1 ميكروغرام / مل pepstatin آپروتينين ) كانت تستخدم لغسل الخلايا مرتين . كشط الخلايا في 2 مل من dpbs الباردة التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني ، ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي ، وتجميد وإرسالها .