الخلفية صفر شقة محطة سريعة استنساخ كيت T4 المبدأ الناقل

نوربولدالخلفية صفر شقة محطة سريعة استنساخ كيت T4 المبدأ الناقل

Zero-Blunt بسيطة سريعة ربط مجموعة
pZERO-Blunt بسيطخلفية الصفر شقة نهاية اتصال سريع كيت(بدون الإشراف (

رقم الدليل : 42113

تكوين مجموعات التخزين والاستقرار :

- 20 ℃ التخزين ، 6 أشهر لا تؤثر على استخدام النتائج .

معايير محددة من المنتجات تخضع المعايير الواردة في مواصفات المنتج

منتوج عرض :

الخلفية صفر شقة نهاية اتصال سريع كيت هو جيد الذاتي شا جين إيجابية انتقائية استنساخ النظام ، يمكن أن كفاءة استنساخ المنتجات PCR شقة نهاية أي شقة نهاية الحمض النووي شظايا . هذه المجموعة هي فعالة في فسفرته أو غير فسفرته الحمض النووي شظايا . أكثر من 90 ٪ من استنساخ المؤتلف إيجابية يمكن الحصول عليها من خلال ربط إيجابية انتقائية ناقلات مع إدراج جزء فقط 5 دقائق . شقة نهاية PCR المنتجات التي تم تضخيمها من قبل بوليميريز ( على سبيل المثال ، pfu polymerase ) مع تصحيح النشاط يمكن أن تكون مرتبطة مباشرة إلى استنساخ ناقلات . ربط المنتجات يمكن أن تتحول إلى سلالات كولاي المشتركة مباشرة .

طقم إليسا يوفر رواية النفس شا جين إيجابية انتقائية استنساخ ناقلات pzero بلونت بسيطة . ناقلات تحتوي على الجينات القاتلة الذاتي شا ، عندما ربط بنجاح مع ناقلات شظايا ، لا يمكن التعبير عن الجينات بشكل صحيح الذاتي شا الخلايا التي تحتوي على المؤتلف يمكن أن تنمو بشكل طبيعي . عندما ربط ناقلات جزء لا يعمل ، ناقلات التعبير عن الجينات بشكل صحيح من شا بعد الربط ، والخلايا التي تحتوي على ناقلات الفضاء لا يمكن البقاء على قيد الحياة ، وهذا هو ، " صفر زيرو " الخلفية . هذه الاستراتيجية لا تحتاج إلى فحص إيجابية لوکوس سروليوس ، وبالتالي تسريع عملية الفرز .

pzero-blunt بسيطة يمكن القضاء على polyclone موقع بالقرب من موقع الإدراج ، لذلك فمن الضروري أن أعرض موقع مناسب على PCR التضخيم التمهيدي . في هذه الحالة ، إذا كان الحمض النووي الحمض النووي هو قطع في موقع عرض PCR التضخيم التمهيدي ، رد فعل الأنزيمية لن تتأثر تقييد الإنزيمات في مواقع أخرى من polyclone قطع على تي ناقلات ، والتي يمكن أن تحسن إلى حد كبير كفاءة القطع وزيادة قوة akron . . . . . . .

خطوات التشغيل :

1. {ج}إعداد رد فعل الاتصالس

شقة نهاية PCR المنتجات أو شقة نهاية شظايا يمكن استردادها عن طريق الاغاروز الكهربائي الهلامي ( باستخدام الأشعة فوق البنفسجية أو الأشعة فوق البنفسجية هلام قطع طويلة انتقال لتجنب الحمض النووي من التلف الناجم عن فشل الاتصال ) . النسبة المولية إلى الناقل هو 3 : 1 . منتجات الحمض النووي التي تنتجها الشركة بسرعة تنقية عدة الانتعاش أكثر من 70 بي جزء من الحمض النووي يمكن أن تكون جيدة جدا في الانتعاش .

2. اتصال سريع رد :

( 1 ) {ج}على مستوى واحدmالانضمام إلى نظام رد فعلmل 40 ، num > < pzero بلانت بسيطة CH التابير 1mل PCR المنتجات ( في ظل الظروف العادية ، ليس هناك حاجة إلى تحديد كمية دقيقة من المنتجات PCR ، عموما نسبة المولي من المنتجات PCR والناقل الأمثل 1 : 1 ~ 10 : 1 يمكن الحصول على نتائج جيدة ، والتوصية 3 : 1 ، انظر التذييل ) ، 5 .ml 2لاQuick Ligation عازلة و 0.9mل T4 الحمض النووي ليغاس ، والباقي هو تكملة مع الماء المعقم .

ويتم الرد وفقا للنظم التالية :

عموما ، T4 الحمض النووي ليغاس تضاف في نهاية المطاف .

( 2 ) {ج}الاتصال في 22 ℃ لمدة 5-10 دقائق ( عادة ما يتم ذلك في جهاز PCR ) .

عادة ، فمن المستحسن أن 22 ℃ الاتصال لمدة 5-10 دقائق ، و > 3 كيلوبايت طويلة جزء اتصال يمكن تمديدها إلى 30 دقيقة . لا ينصح لأكثر من 30 دقيقة ، أكثر من المرجح أن تقلل من عدد من المحولات .

( 3 ) {ج}تبريد الجليد ، ثم تحويلها أو تخزينها في - 20 ℃ . . . . . . .

3. تحويل

( 1 ) {ج}100mل الخلايا المستقبلة ، وضعت على الجليد ، بعد quan مذاب ، خفقت عدة مرات لتعليق الخلايا بالتساوي .

( 2 ) {ج}إضافة 4-5mل ربط السائل ( الحد الأقصى يمكن أن تضاف ، طالما أن حجم السائل لا يتجاوز 1 / 10 من حجم الخلايا المستقبلة ) ، بلطف مزيج . يوضع الثلج لمدة 30 دقيقة .

( 3 ) {ج}42 ℃ حمام الماء صدمة الحرارة 90 ثانية . يوضع الثلج لمدة 2-3 دقائق .

( 4 ) {ج}زائدmل رطل أو شركة نفط الجنوب متوسطة ( لا تحتوي على المضادات الحيوية ) ، 37 ℃ 150 دورة في الدقيقة تتأرجح الثقافة لمدة 60 دقيقة .

( 5 ) {ج}لmل البكتيريا المغلفة على أمبيرmز / مل ) على لوحة مسطحة .

إذا كان من المتوقع أن يكون هناك عدد أقل من الاستنساخ ، بعض وسائل الإعلام يمكن أن يكون امتص من قبل الطرد المركزي ( 4 ، 000 دورة في الدقيقة ، 2 دقيقة ) ، ثم ترك كمية مناسبة من وسائل الإعلام تعليق ، ثم أخذ كل أو كمية مناسبة من الطلاء على لوحة مسطحة ( طلاء المتبقية من وسائل الإعلام يمكن أن يوضع في 4 درجات التخزين ، في اليوم الثاني إذا كان عدد من تحويل مستعمرة صغيرة ، كل ما تبقى من وسائل الإعلام يمكن أن تكون مغلفة مع ثقافة جديدة لوحة ) .

( 6 ) {ج}لوحة وضعت بشكل إيجابي في 37 ℃ لمدة 1 ساعة لاستيعاب الكثير من السوائل ، ثم مقلوب الثقافة بين عشية وضحاها .

4. فحص

5. الكشف الروتيني : الحصول على مستعمرة تلقيح 1-5 مل رطلmز / مل أمبير تشينغ mycin ) متوسطة الثقافة في 37 ℃ تتأرجح بين عشية وضحاها ، بعد الحفاظ على البكتيريا ، البلازميد تم استخراجها ، بكر أو انزيم الهضم استخدمت طريقة لتحديد ما إذا كان إدراج جزء كان صحيحا .

6. الكشف السريع : اختيار المستعمرات مباشرة عن طريق الاسترداد ( انظر النسخة الثالثة من الاستنساخ الجزيئي أو الرجوع إلى الشركة cv05-t-carrier مستعمرة بكر تحديد كيت المواصفات ) .

7. {ج}التسلسل : تحديد ما إذا كان أو لم يكن الهدف من الاستنساخ هو متسلسلة باستخدام عدة التمهيدي أو T7 المروج التمهيدي .

هذه المجموعة تأتي مع تسلسل التمهيدي ( كما تستخدم لتحديد مستعمرة بكر التمهيدي ) :

التذييل

ديدو كيفية حساب الكمية المطلوبة من المنتجات PCR في ربط رد الفعل ؟

النسبة المولية بين المنتج و الناقل PCR هو الأمثل من 1 : 1 إلى 10 : 1 ( التوصية 3 : 1 ) للحصول على نتائج جيدة .

على سبيل المثال ، فإن النسبة المولية من إدراج جزء من الناقل إلى الناقل هو 3 : 1 ، على سبيل المثال ، إذا كان الناقل هو 40 نانوغرام في ربط رد الفعل ، إدراج جزء من حجم 500 بي بي ، ثم إدراج جزء من حجم [ 40 نانوغرام × 0.5kb إدراج جزء من الناقل هو 2.974kb 2.2 نانوغرام / 1 = 20.2 نانوغرام .

الخلفية صفر شقة محطة سريعة استنساخ كيت T4 المبدأ الناقل