خطوة واحدة seamless تنظيف كيت استنساخ سلس

نوربولدخطوة واحدة seamless تنظيف كيت استنساخ سلس

مجموعة استنساخ سلسة خطوة واحدة (جزء واحدو

رقم الدليل :42111

كمية التغليف :

تخزين المنتجات :-20سج التخزين ، وتجنب تكرار التجميد والذوبان

معايير محددة من المنتجات تخضع المعايير الواردة في مواصفات المنتج

وصف المنتج :خطوة واحدة سلس استنساخ عدة مستقلةT4الليباز لا تقتصر على مواقع انزيم الهضم من الناقل و الهدف جزء ، ولكن مباشرة من خلال طريقة التركيب من تداخل جزء ، أي طريقة يمكن أن تكون خطية من الناقل مع انزيم الخاصة الجمع بين اثنين من المحطات الطرفية التي يتم توفيرها مع الليباز .16-25bpتداخل المنطقةالـ PCRجزء المنحى المؤتلف الصدد30تحقيق في دقائقAنهاية أو نهاية مسطحةالـ PCRالمنتج شظايا يمكن استنساخها بسهولة في أي موقع من ناقلات .

ميزات المنتج :

1. 30دقيقة واحدة50bp-15kb PCRتضخيم جزء/ ألفاستنساخ إدراجها في أي مكان في أي ناقل .

2.توافر مواقع خالية من ناقلات و إدراج شظايانهاية سلميةو粘性末端的限يمكن استنساخ في أي موقع .

3. استنساخ سلس ، نقطة الإدراج لن أعرض غير المرغوب فيها قاعدة تسلسل .

4. لا تعتمد على ليجاسى و الفوسفاتيز ، عالية الكفاءة والدقة95%أعلاه .

رسم تخطيطي خطوة واحدة سلس استنساخ كيت :

خطي الناقل الإدراجالحمض النوويإعداد الشظايا :

A: إعداد الناقل الخطي

(1).مصدر إنزيم الهضم :خطي الناقل التي تم الحصول عليها عن طريق انزيم الهضم يمكن أن تكون إما شقة نهاية أو نهاية لزجة ، واحدة أو مزدوجة enzymolysis enzymolysis ، الغراء يمكن استردادها بعد enzymolysis . . . . . . .

ملاحظة : ليس هناك سلسلة مزدوجة في خطوة واحدة سلس استنساخ نظام رد فعلالحمض النوويليجاسى ، الناقل الذاتي ربط رد فعل لا يحدث . وبناء على ذلك ، حتى لو كان خطي الناقل أعدته إنزيم واحد طريقة الهضم لا تتطلب محطة dephosphorization العلاج . استنساخ إيجابية كاذبة بعد التحول من المنتجات المؤتلف(أي إدراج جزءوهو شكل من أشكال التحول من quan-unlinearized الناقل . ونحن نوصي بأن نسبة غير الخطية من الناقلين يمكن أن تنخفض إلى أقصى درجة دي بعد الأنزيمية الهضم .

(2).عكسالـ PCRالمصدر :اقترح استخدام عالية الدقةالحمض النوويبوليميريزP517-05أوP812-05) إعداد ، إذا كان يمكن تمرير شريط واحد من التضخيمالـ PCRتنقية المنتجDC012-50الحصول على الناقل ، وإلا عن طريق إعادة تدوير الغراء ( رقم الشحن :DC011-50)الحصول على الناقل .

ملاحظة : عكسالـ PCRبلازميد القالب هو أيضا غير الخطية ناقلات ، والتي قد تؤدي إلى استنساخ إيجابية كاذبة ( أي إدراج جزء ) .الـ PCRناقل خطي المصدر )الـ PCRقبل تنقيةدبن الأولانزيم الهضم البلازميد قالب يمكن أن تقلل من الخلفية ، وتحسين معدل الإيجابية . ومع ذلك ، في ظل الظروف العادية ، بعد إعادة تدوير المطاط كافية للحد من نسبة هذا الناقل غير الخطيةالـ PCRكما نوصي بإعادة تدوير الصمغ .

Bإدراجالحمض النوويإعداد جزء

(1).المبدأ العام خطوة واحدة استنساخ التمهيدي تصميم سلسسفي نهاية المطاف ، تسلسل مثلي من محطة استنساخ ناقلات عرض خطي . . . . . . .سوسفي نهاية المطاف ، على التوالي ، مع الانتهاء من quans تسلسل المقابلة لكل من ينتهي من خطي استنساخ ناقلات .(16 نقطة أساسية)و20 نقطة أساسية)منتدى

(2).إدراج جزء التمهيدي تصميم : استنساخ التمهيدي يتضمن إدراج جزء محدد التمهيدي و تداخل تسلسل .

استنساخ التمهيدي إلى الأمام(5’-3’)الناقل الخطي إلى الأمام16-25 ntتداخل المنطقة تسلسل(3نهاية العدسإدراج تسلسل التمهيدي محددة إلى الأمام )18-25 ntو

استنساخ عكس التمهيدي(5’-3’): عكس الناقل الخطي16-25 ntتداخل المنطقة تسلسل(3نهاية العدسإدراج جزء محدد عكس تسلسل التمهيدي )18-25 ntو

ملاحظة : قاعدة قاعدة في منطقة التداخل على الأقل16 نقطةبين عدة مناطق متداخلةتي امالقيم يجب أن تكون متسقة و > .60 درجة مئوية (زوج AT = 2 درجة مئوية وزوج GC = 4 درجة مئوية)خلاف ذلك ، يمكن تمديد عدد القواعد حتى يتم الوفاء بالشروط .

وفقا لهيكل نهاية الناقل الخطي )5جاحظ3تصميم الاشعال كما تم تقسيم3وفيما يلي وصف للحالة :

كلا نهايات من خطي الناقلين تختلف في طرق خطية ( على سبيل المثال ، واحدة مزدوجة انزيم الهضم الهضم ، عكسالـ PCRمختلفة ، يمكن أن يكون أي مزيج من اثنين أو أكثر من ثلاثة أنواع من الهياكل الطرفية ، مبدأ إدراج جزء محدد التمهيدي تصميم يتبع المبدأ العام التمهيدي تصميم .

عند حساب درجة حرارة التخمير من التضخيم التمهيديتي اممحطة ناقلات مثلي لا ينبغي أن تشارك في الحساب .

(3).اختيار انزيم : اقترح استخدام مرحبا فايالحمض النوويبوليميريزخليط PCR( رقم الشحن :P517-05أوP814-05. لا

(4).رد الفعل : عموما وفقا لتعليمات محددة بوليميريز يمكن استخدامها .

(5).تنقية إدراج جزء

l اختياريا ، إذا كان جزء يأتي من قالب البلازميد البلازميد المؤتلف ناقلات لها نفس المقاومة .دبن الأولانزيم الهضم البلازميد قالب يمكن أن تقلل من الخلفية ، وتحسين معدل الإيجابية .

l إذا كان جزء واحد ، فمن المستحسن استخدامالـ PCRتنقية المنتج كيتDC012-100تنقية جزء .

l إذا كان هناك غير محددة التضخيم ، فمن المستحسن استخدام هلام الانتعاش كيتDC011-100)إعادة تدوير شظايا .

l إذا كان هناك متطلبات صارمة على موقع انزيم الهضم ، فمن المستحسن أن نولي اهتماما لاختيار موقع انزيم الهضمبين تداخل المنطقة تسلسل تسلسل الجينات الخاصة الإيجابية والسلبية استنساخ التمهيديإضافة قاعدة مفقودة لاستعادة الموقع الأصلي ( انظر المثال التالي ) .

l إذا كانت البلازميدات المؤتلف تستخدم في التعبير عن البروتين ، ثم لاحظ قراءة الإطار ، تسلسل البروتين التعبير وتنقية ( على سبيل المثال ، المروج ،شركة RBSتسلسل ، رامزة البداية ، إنهاء رامزة ، تسمية البروتين ، الخ

إلى الأمام تصميم التمهيدي على سبيل المثال )إيكور Iشق إنزيم (

كما هو مبين أعلاه ، الناقل يتكون منإيكور الأولإنزيم شق5نهاية بارزة :

وفقا لمبادئ التصميم المذكورة أعلاه ، من3نهاية يبدأ العد ، عد إلى الوراء .16bp-25bp( هذا المثال يستخدم20 bpمحطة متداخلة مع نفس تسلسل ) ، إضافة إلى الهدف جزء محدد التمهيدي تسلسل . ضمان تداخل المناطقتي امالقيم تبقى متسقة و60 درجة مئوية (زوج AT = 2 درجة مئوية وزوج GC = 4 درجة مئوية)منتدى

التمهيدي محددة على النحو التالي :5GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNN3

ملاحظة : بعد الانتهاء من تصميم التمهيدي أعلاه ، تم ربط استنساخ ،إيكور Iقطع الموقع سوف تختفي ( لا قطع الموقع ) .

إذا لزم الأمر الاحتفاظإيكور Iموقع إنزيم ، تحتاج إلى أن تكون في نهاية الناقل20 bpتكمل الحذف بين تداخل تسلسل الهدف جزء محدد التمهيديإيكور Iتسلسل الاعترافaattc، بعد الانتهاء من استنساخ الاتصال ،إيكور Iلا تزال هناك مواقع إنزيم الهضم ( الحفاظ على مواقع إنزيم الهضم ) .

على وجه التحديد على النحو التالي :5 GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNN3

أمثلة على عكس التصميم التمهيدي )هند الثالثشق إنزيم (

كما هو مبين أعلاه ، الناقل يتكون منهند الثالثإنزيم شق5نهاية بارزة :

وفقا لمبادئ التصميم المذكورة أعلاه ، من3نهاية يبدأ العد ، عد إلى الوراء .16bp-25bp( هذا المثال يستخدم20 bpمحطة متداخلة مع نفس تسلسل ) ، إضافة إلى الهدف جزء محدد التمهيدي تسلسل . ضمان تداخل المناطقتي امالقيم تبقى متسقة و60 درجة مئوية (زوج AT = 2 درجة مئوية وزوج GC = 4 درجة مئوية)منتدى

عكس التمهيدي محددة على النحو التالي :5CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNN 3'

ملاحظة : بعد الانتهاء من تصميم التمهيدي أعلاه ، تم ربط استنساخ ،هند الثالثقطع الموقع سوف تختفي ( لا قطع الموقع ) .

إذا لزم الأمر الاحتفاظهند الثالثموقع إنزيم ، تحتاج إلى أن تكون في نهاية الناقل20 bpتكمل الحذف بين تداخل تسلسل الهدف جزء محدد التمهيديهند الثالثتسلسل الاعترافagcttوهند الثالثلا تزال هناك مواقع إنزيم الهضم ( الحفاظ على مواقع إنزيم الهضم ) .

على وجه التحديد على النحو التالي :5 CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNN 3'

الخطوات التنفيذية سلس استنساخ فعل :

ملاحظة2 × مزيج استنساخ OneStepيحتوي على اتصال محسنبيجعندما تكون درجة الحرارة منخفضة ، نماذج المنفعة يمكن أن توضع في النخيل المجمدة لبضع دقائق لزيادة درجة الحرارة ، وبالتالي تقليل اللزوجة ( لا تؤثر على الجودة ) ، وخفيفة الوزن يمكن أن تكون مختلطة بالتساوي ، وعلى الفور يتم جمعها في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي .

1. إنشاء نظام رد الفعل وفقا للجدول التاليالـ PCRالأنابيب المركبة في درجة حرارة الغرفة (

* الناقل العام20-50 ngالنسبة المولية بين إدراج جزء والناقل2 : 1-3 : 1بين أفضل ; إذا كان إدراج جزء أقل من200bpالنسبة المولية من إدراج جزء من الناقل5 : 1منتدى

2. تخلط جيداً برفق50سCرد فعل .15دقيقةالـ PCRبعد الانتهاء من رد الفعلالـ PCRمباشرة بعد وضع أنبوب على الجليد أو تخزينها في-20سCقصاصات قصيرة مثل100bp-1kbفقط بحاجة إلى15ما يكفي من transformants يمكن الحصول عليها في غضون 10 دقائق ، وربط أجزاء أطول ، مما يطيل من وقت رد الفعل60دقيقة .

3. 取5 ميكرولتررد فعل المنتج هو تحويلها وفقا لتعليمات من الخلايا المستقبلة ( إذا كان هناك عدد أقل من transformants ، جميع المنتجات يمكن أن تتحول جميع transformants يمكن المغلفة مع لوحات ) .

تحديد استنساخ إيجابية :

مستعمرة يمكن اختيارها وفقا للظروف المحددةالـ PCRتحديد واستخراج البلازميد31013-100تقييد endonuclease تحديد أو تحديد تسلسل .

خطوة واحدة seamless تنظيف كيت استنساخ سلس