blue-t ناقلات بسيطة وسريعة استنساخ كيت T4

pBLUE-T بسيطةالناقل السريع استنساخ كيت

blue-t ناقلات بسيطة وسريعة استنساخ كيت T4

رقم الدليل :42119

تكوين مجموعات التخزين والاستقرار :

- 20 ℃ التخزين ، 6 أشهر لا تؤثر على استخدام النتائج .

منتوج عرض :

إن pblue-t ناقلات بسيطة هو نوع من كفاءة عالية استنساخ PCR المنتج ( تا cloning ) الناقل . على عكس التقليدية تي ناقلات ECOR الخامس ، psure-t بسيطة يمكن أن تنتج مباشرة unmatched t-bases في 3 ' ends على كلا الجانبين من الموقع الأصلي من خلال تعديل pbluescript الثاني كورونا ( + ) ، مما أدى إلى ارتفاع كفاءة إعادة التركيب . وفي الوقت نفسه ، فإنه يزيل polyclone مواقع على pbluescript الثاني كورونا ( + ) ناقلات ، لذلك نحن بحاجة إلى إدخال مواقع مناسبة على PCR التضخيم التمهيدي . في هذه الحالة ، إذا كان الحمض النووي الحمض النووي هو قطع في موقع عرض PCR التضخيم التمهيدي ، رد فعل الأنزيمية لن تتأثر تقييد الإنزيمات في مواقع أخرى من polyclone قطع على تي ناقلات ، والتي يمكن أن تحسن إلى حد كبير كفاءة القطع وزيادة قوة akron . . . . . . . وبالإضافة إلى ذلك ، فإن الشركة الناقل نظام الاتصال لديها أيضا خلفية منخفضة ( أقل من 10 في المائة من البقع الزرقاء ) ، وارتفاع معدل إعادة التركيب ( أكثر من 90 ٪ من البقع البيضاء هناك إدراج أجزاء ) ، يمكن أن تكون مرتبطة بسرعة ، وهلم جرا . في نهاية هذا الدليل ، البيانات التقنية ذات الصلة من pblue-t ناقلات بسيطة مدرجة . تسلسل كامل يمكن الرجوع إلى pbluescript الثاني كورونا ( + ) تسلسل ، ولكن تسلسل في مواقع مختلفة قليلا .

تسلسل M13 العالمي التمهيدي و T3 المروج التمهيدي الموصى بها .
خطوات التشغيل :
1 - ربط إعداد الردود

إذا كان المنتج PCR هو تنقية أو لا يعتمد على نوعية المنتج PCR التضخيم . إذا كان المنتج PCR نظيفة جدا ، يمكن أن تكون مرتبطة مباشرة دون تنقية . ومع ذلك ، إذا كان المنتج PCR باستخدام البلازميد كقالب ، ثم يجب تنقيته . المنتجات PCR يمكن فصلها عن طريق الاغاروز الكهربائي الهلامي . منتجات الحمض النووي التي تنتجها الشركة بسرعة تنقية عدة الانتعاش أكثر من 70 بي جزء من الحمض النووي يمكن أن تكون جيدة جدا في الانتعاش .

بكر المنتجات التي تم تضخيمها من قبل طق ، ث ، amplitaq و klentaq بوليميريز الحمض النووي ، مع تسليط الضوء على 3-مع-بكر المنتجات في محطة يمكن أن تكون مرتبطة مباشرة مع pblue-t بسيطة ناقلات . مع®5 ' exoenzyme النشاط بوليميريز الحمض النووي ( عالية الدقة انزيم ) تضخيم PCR المنتجات المسطحة ، استنساخ هذه المنتجات المسطحة ، ينبغي أن يكون أول 3 ' ■ PCR-نهاية زائد العمل .

2. ردود الفعل المشتركة :

( 1 ) على مستوى واحدmالانضمام إلى نظام رد فعلmل 30 ٪ Pblue-T بسيطةmل PCR المنتجات ( في ظل الظروف العادية ، ليس هناك حاجة إلى كمية دقيقة من المنتجات PCR ، PCR المنتجات الناقل العام الأمثل الخلد نسبة 2 : 1 ~ 10 : 1 يمكن الحصول على نتائج جيدة ، والتوصية 3 : 1 ) ، 1ml 10لارفع عازلة و 0.5-1mل ( 2.5-5 وحدات فايس ) T4 الحمض النووي ليغاس ، والباقي من الماء . ويتم الرد وفقا للنظم التالية :

عموما ، T4 الحمض النووي ليغاس تضاف في نهاية المطاف .

( 2 ) الاتصال بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية ( عادة ما يتم ذلك في جهاز PCR ) .

يوصى عادة 16 درجة مئوية للاتصال بين عشية وضحاهاmل مستوى ليجاسى كمية 2.5 ويس الوحدات ، ويمكن الحصول على معظم transformants . . . . . . . ومع ذلك ، هذا النظام يحتوي على شماعة enhancer يمكن أن تزيد من كفاءة الاتصال عدة مرات .mل نظام يوصى ليجاسى كمية 5 وحدات فايس ) في 16 ℃ لمدة 30 دقيقة ، والتي يمكن أن تلبي متطلبات الدراسة العامة .

( 3 ) تبريد الجليد ، ثم تحويلها أو تخزينها في - 20 ℃ . . . . . . .

3. اتصال سريع رد :

( 1 ) ويتم الرد وفقا للنظم التالية :

عموما ، T4 الحمض النووي ليغاس تضاف في نهاية المطاف .

( 2 ) الاتصال في 22 ℃ لمدة 5-10 دقائق ( عادة ما يتم ذلك في جهاز PCR ) .

2 لاقائمة سريعة عازلة يحتوي بالفعل على جميع المكونات الأمثل اتصال سريع ، وعادة ما يوصى الاتصال في 22 درجة مئوية لمدة 10 دقائق .mل نظام ليجاسى كمية 5 وحدات فايس ، شظايا طويلة يمكن أن تمتد إلى 30 دقيقة . وبالإضافة إلى ذلك ، يمكن للنظام أيضا أن تكون متصلا في 16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقةmكمية ليغاز في النظام هو 5 وحدات فايس

( 3 ) تبريد الجليد ، ثم تحويلها أو تخزينها في - 20 ℃ . . . . . . .

4. تحويل

في 50-100mل الخلايا المستقبلة ، وضعت على الجليد ، وان مذاب تماما بعد عدة مرات برفق فرشاة تعليق الخلايا بالتساوي .

في إضافة 4-5mل ربط الحل ( يمكن إضافة ما يصل إلى 1 / 10 من حجم الخلايا المستقبلة ) ، بلطف مزيج . يوضع الثلج لمدة 30 دقيقة . 42 ℃ حمام الماء صدمة الحرارة 90 ثانية . يوضع الثلج لمدة 2-3 دقائق .

في زائدmل رطل أو شركة نفط الجنوب متوسطة ( لا تحتوي على المضادات الحيوية ) ، 37 ℃ 150 دورة في الدقيقة تتأرجح الثقافة لمدة 60 دقيقة .

في لmل البكتيريا المغلفة قبل استخدام 16mل 50 ملغ / مل IPTG و 40mل 20 ملغ / مل x-gal المغلفة على أمبيسيليوم سو لوحة .

إذا كان من المتوقع أن يكون هناك عدد أقل من الاستنساخ ، بعض وسائل الإعلام يمكن أن يكون امتص من قبل الطرد المركزي ( 4 ، 000 دورة في الدقيقة ، 2 دقيقة ) ، ثم ترك كمية مناسبة من وسائل الإعلام تعليق ، ثم أخذ كل أو كمية مناسبة من الطلاء على لوحة مسطحة ( طلاء المتبقية من وسائل الإعلام يمكن أن يوضع في 4 درجات التخزين ، في اليوم الثاني إذا كان عدد من تحويل مستعمرة صغيرة ، كل ما تبقى من وسائل الإعلام يمكن أن تكون المغلفة مع ثقافة جديدة لوحة ) .

في لوحة وضعت بشكل إيجابي في 37 ℃ لمدة 1 ساعة لاستيعاب الكثير من السوائل ، ثم مقلوب الثقافة بين عشية وضحاها .

5 فحص

1 . الأزرق والأبيض فحص المحولات :

عندما يتم إدراج الحمض النووي الأجنبية جزء في pblue-t بسيطة ، lacz ترميز الجينات قد تغيرت بسبب وجود تسلسل الحمض النووي الأجنبية ، مما يؤثر علىب -جالاكتوسيداسيأ -ولذلك ، المؤتلف استنساخ يظهر اللون الأبيض على x-gal / IPTG لوحة ، ولكن ليس اللون الأزرق . في بعض الأحيان ، إدراج جزء لا يؤثر على lacz جين القراءة الإطار ، أو إدراج جزء صغير جدا ، في هذه الحالة مستعمرة ( المؤتلف استنساخ ) يظهر الضوء الأزرق أو في مركز مستعمرة تظهر بقعة زرقاء شاحبة ، الأبيض ( سمك العين الزرقاء العين ) . أبيض أو أزرق شاحب المستعمرات التي نمت على iptg / x-gal لوحة تم اختيارهم من قبل المسواك إلى متوسطة الثقافة التي تحتوي على ambipenicillium سو ، ومثقف في 37 ℃ بين عشية وضحاها .

2 . تحديد transformants :

أ. البلازميد المستخرج من السائل من مستعمرة بيضاء ومثقف ، انزيم الهضم في موقع الإدراج جزء يستخدم انزيم الهضم ، الاغاروز الكهربائي الهلامي يستخدم لفحص حجم جزء لتحديد ما إذا كان الهدف جزء موجود .

ب. اختيار مستعمرة بيضاء للكشف عن بكر مباشرة

ج. استخدام T3 المروج التمهيدي أو M13 العالمي تسلسل التمهيدي لتحديد ما إذا كان يحتوي على استنساخ الهدف . . . . . . .

في كيفية حساب الكمية المطلوبة من المنتجات PCR في ربط رد الفعل ؟

عموما النسبة المولية بين المنتج و الناقل PCR الأمثل 2 : 1 ~ 10 : 1 ( التوصية 3 : 1 ) للحصول على نتائج جيدة .

على سبيل المثال ، فإن النسبة المولية من إدراج جزء من الناقل إلى الناقل هو 3 : 1 ، على سبيل المثال ، إذا كان الناقل هو 40 نانوغرام في ربط رد الفعل ، إدراج جزء من حجم 1000 بي بي ، ثم إدراج جزء من حجم [ 40 نانوغرام الناقل × 1 كيلوبايت إدراج جزء من 2.928 كيلوبايت ] × 40.1 نانوغرام / 1 .

blue-t ناقلات بسيطة وسريعة استنساخ كيت T4