الخلفية صفر شقة نهاية سريعة استنساخ كيت T4

صفر-ضبابيةالخلفية صفر شقة نهاية سريعة استنساخ كيت

الخلفية صفر شقة نهاية سريعة استنساخ كيت T4

رقم الدليل :42018

تكوين مجموعات التخزين والاستقرار :

- 20 ℃ التخزين ، 6 أشهر لا تؤثر على استخدام النتائج .

v منتوج عرض :

الخلفية صفر شقة نهاية اتصال سريع كيت هو ممتاز زي قتل الجينات إيجابية انتقائية استنساخ النظام ، والتي يمكن أن كفاءة استنساخ المنتجات PCR شقة نهاية أي جزء من الحمض النووي مع شقة نهاية . هذه المجموعة هي فعالة في فسفرته أو غير فسفرته الحمض النووي شظايا . أكثر من 95 ٪ من استنساخ المؤتلف إيجابية يمكن الحصول عليها من خلال ربط إيجابية انتقائية ناقلات مع إدراج جزء فقط 5 دقائق . شقة نهاية PCR المنتجات التي تم تضخيمها من قبل بوليميريز ( على سبيل المثال ، pfu polymerase ) مع تصحيح النشاط يمكن أن تكون مرتبطة مباشرة إلى استنساخ ناقلات . ربط المنتجات يمكن أن تتحول إلى سلالات كولاي المشتركة مباشرة .

كيت يوفر رواية زي قتل الجينات إيجابية انتقائية استنساخ ناقلات pzero بلونت . ناقلات تحتوي على جينات قاتلة زي قتل ( تحتوي على مواقع متعددة استنساخ ) . عندما ربط ناقلات مع شظايا ، زي قتل الجينات لا يمكن التعبير عنها بشكل صحيح . عندما ربط ناقلات جزء لا يعمل ، زي قتل الجينات عن بشكل صحيح بعد ربط ناقلات ، والخلايا التي تحتوي على ناقلات فارغة لا يمكن البقاء على قيد الحياة ، وهذا هو ، " صفر زيرو " الخلفية . هذه الاستراتيجية لا تحتاج إلى فحص إيجابية لوکوس سروليوس ، وبالتالي تسريع عملية الفرز .

من أجل تسهيل عملية الهضم و إدراج جزء من الجينات ، bglii الاعتراف تسلسل الواردة في كلا الجانبين من مواقع متعددة استنساخ ناقلات pzero بلونت . . . . . . . وبالإضافة إلى ذلك ، تحتوي على ناقلات T7 المروج ، والتي يمكن استخدامها في المختبر والمجراة في النسخ ، إدراج جزء التسلسل .

خطوات التشغيل :

1. إعداد ردود الاتصال :

شقة نهاية PCR المنتجات أو شقة نهاية شظايا يمكن استردادها عن طريق الاغاروز الكهربائي الهلامي ( باستخدام الأشعة فوق البنفسجية أو الأشعة فوق البنفسجية هلام قطع طويلة انتقال لتجنب الحمض النووي من التلف الناجم عن فشل الاتصال ) . النسبة المولية إلى الناقل هو 3 : 1 . منتجات الحمض النووي التي تنتجها الشركة بسرعة تنقية عدة الانتعاش أكثر من 70 بي جزء من الحمض النووي يمكن أن تكون جيدة جدا في الانتعاش .

2. اتصال سريع رد :

( 1 ) على مستوى واحدmالانضمام إلى نظام رد فعلmل 40 ، < num > Pzero بلانت Ch ş 1mل PCR المنتجات ( في ظل الظروف العادية ، ليس هناك حاجة إلى تحديد كمية دقيقة من المنتجات PCR ، عموما نسبة المولي من المنتجات PCR والناقل الأمثل 1 : 1 ~ 10 : 1 يمكن الحصول على نتائج جيدة ، والتوصية 3 : 1 ، انظر التذييل ) ، 5 .ml 2لاQuick Ligation عازلة و 0.9mل T4 الحمض النووي ليغاس ، والباقي هو تكملة مع الماء المعقم .

ويتم الرد وفقا للنظم التالية :

عموما ، T4 الحمض النووي ليغاس تضاف في نهاية المطاف .

( 2 ) الاتصال في 22 ℃ لمدة 5-10 دقائق ( عادة ما يتم ذلك في جهاز PCR ) .

عادة ، فمن المستحسن أن 22 ℃ الاتصال لمدة 5-10 دقائق ، و > 3 كيلوبايت طويلة جزء اتصال يمكن تمديدها إلى 30 دقيقة . لا ينصح لأكثر من 30 دقيقة ، أكثر من المرجح أن تقلل من عدد من المحولات .

( 3 ) تبريد الجليد ، ثم تحويلها أو تخزينها في - 20 ℃ . . . . . . .

3. تحويل

( 1 ) 100mل الخلايا المستقبلة ، وضعت على الجليد ، وان مذاب تماما بعد عدة مرات برفق فرشاة تعليق الخلايا بالتساوي .

( 2 ) إضافة 4-5mل ربط السائل ( الحد الأقصى يمكن أن تضاف ، طالما أن حجم السائل لا يتجاوز 1 / 10 من حجم الخلايا المستقبلة ) ، بلطف مزيج . يوضع الثلج لمدة 30 دقيقة .

( 3 ) 42 ℃ حمام الماء صدمة الحرارة 90 ثانية . يوضع الثلج لمدة 2-3 دقائق .

( 4 ) زائدmل رطل أو شركة نفط الجنوب متوسطة ( لا تحتوي على المضادات الحيوية ) ، 37 ℃ 150 دورة في الدقيقة تتأرجح الثقافة لمدة 60 دقيقة .

( 5 ) لmالبكتيريا المغلفة على أمبيسيليوم سوmز / مل ) على لوحة مسطحة .

إذا كان من المتوقع أن يكون هناك عدد أقل من الاستنساخ ، بعض وسائل الإعلام يمكن أن يكون امتص من قبل الطرد المركزي ( 4 ، 000 دورة في الدقيقة ، 2 دقيقة ) ، ثم ترك كمية مناسبة من وسائل الإعلام تعليق ، ثم أخذ كل أو كمية مناسبة من الطلاء على لوحة مسطحة ( طلاء المتبقية من وسائل الإعلام يمكن أن يوضع في 4 درجات التخزين ، في اليوم الثاني إذا كان عدد من تحويل مستعمرة صغيرة ، كل ما تبقى من وسائل الإعلام يمكن أن تكون مغلفة مع ثقافة جديدة لوحة ) .

( 6 ) لوحة وضعت بشكل إيجابي في 37 ℃ لمدة 1 ساعة لاستيعاب الكثير من السوائل ، ثم مقلوب الثقافة بين عشية وضحاها .

5 فحص

1 . الكشف الروتيني : الحصول على مستعمرة تلقيح 1-5 مل رطلmز / مل أمبيسيليوم سو ) متوسطة الثقافة في 37 ℃ تتأرجح بين عشية وضحاها ، ثم استخراج البلازميد بعد الحفاظ على سلالة ، بكر أو انزيم الهضم استخدمت طريقة لتحديد ما إذا كان إدراج جزء كان صحيحا .

2 . الكشف السريع : اختيار المستعمرات مباشرة عن طريق الاسترداد ( انظر النسخة الثالثة من الاستنساخ الجزيئي أو الرجوع إلى الشركة cv05-t-carrier مستعمرة بكر تحديد كيت المواصفات ) .
3 . التسلسل : تحديد ما إذا كان أو لم يكن الهدف من الاستنساخ هو متسلسلة باستخدام عدة التمهيدي أو T7 المروج التمهيدي .

هذه المجموعة تأتي مع تسلسل التمهيدي ( كما تستخدم لتحديد مستعمرة بكر التمهيدي ) :

v التذييل

في كيفية حساب الكمية المطلوبة من المنتجات PCR في ربط رد الفعل ؟

النسبة المولية بين المنتج و الناقل PCR هو الأمثل من 1 : 1 إلى 10 : 1 ( التوصية 3 : 1 ) للحصول على نتائج جيدة .

على سبيل المثال ، فإن النسبة المولية من إدراج جزء من الناقل إلى الناقل هو 3 : 1 ، على سبيل المثال ، إذا كان الناقل هو 40 نانوغرام في ربط رد الفعل ، إدراج جزء من حجم 500 بي بي ، ثم إدراج جزء من حجم [ 40 نانوغرام × 0.5kb إدراج جزء من الناقل هو 2.974kb 2.2 نانوغرام / 1 = 20.2 نانوغرام .

الخلفية صفر شقة نهاية سريعة استنساخ كيت T4