خطوة واحدة seamless تنظيف كيت استنساخ سلس

مجموعة استنساخ سلسة خطوة واحدة (جزء واحد (

خطوة واحدة seamless تنظيف كيت استنساخ سلس

رقم الدليل :42111

كمية التغليف :

تخزين المنتجات :-20سج التخزين ، وتجنب تكرار التجميد والذوبان

وصف المنتج :خطوة واحدة سلس استنساخ كيت لا تعتمد على T4 ليغاز و لا تقتصر على مواقع قطع من الناقل و الهدف من شظايا ، ولكن مباشرة من خلال طريقة التركيب من تداخل شظايا ، الناقل بعد أي طريقة خطية و بكر شظايا مع 16-25bp تداخل المناطق في كلا طرفي يمكن أن تكون مرتبطة مع بعضها البعض عن طريق استخدام مزيج خاص من الإنزيمات .

ميزات المنتج :

1. 50bp-15kb PCR التضخيم جزء ( شقة / محطة ) يمكن أن تكون مستنسخة و إدراجها في أي مكان في 30 دقيقة .

2 . يمكن استنساخ في أي موقع دون قيود من قبل الناقل و الإدراج في الموقع و نهاية / نهاية لزجة .

3. استنساخ سلس ، نقطة الإدراج لن أعرض غير المرغوب فيها قاعدة تسلسل .

4. لا تعتمد على ليغاز و الفوسفاتيز ، عالية الكفاءة والدقة ، استنساخ معدل الإيجابية يمكن أن تصل إلى أكثر من 95 ٪ .

رسم تخطيطي خطوة واحدة سلس استنساخ كيت :

إعداد ناقلات الخطية وإدراج شظايا الحمض النووي :

A: إعداد الناقل الخطي

( 1 ) . المصدر : خطي انزيم الهضم الناقل ، شقة أو لزجة نهاية ، واحدة أو مزدوجة انزيم الهضم الهضم يمكن استردادها بعد الهضم .

ملاحظة : في خطوة واحدة نظام سلس استنساخ الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ليجاسى لا يحدث . وبناء على ذلك ، حتى لو كان خطي الناقل أعدته إنزيم واحد طريقة الهضم لا تتطلب محطة dephosphorization العلاج . استنساخ إيجابية كاذبة ( أي إدراج جزء ) بعد التحول من المنتجات المؤتلف تم تحويلها من قبل غير الخطية تماما حلقة الناقل . ونحن نوصي بأن نسبة غير خطية من الناقلين يمكن تخفيضها إلى انخفاض زوي بعد الأنزيمية الهضم .

( 2 ) . عكس بكر المصدر : اقترح استخدام عالية الدقة بوليميريز الحمض النووي ، إذا كان واحد من التضخيم الشريط يمكن تنقيته من قبل المنتج PCR ( السلع رقم : dc012-50 ) للحصول على ناقلات ، أو من خلال استعادة الغراء ( السلع رقم : dc011-50 ) للحصول على ناقلات .

ملاحظة : بلازميد قالب عكس PCR هو أيضا غير الخطية ناقلات ، والتي قد تؤدي إلى استنساخ إيجابية كاذبة ( أي إدراج جزء ) . ولذلك ، البلازميد قالب يمكن هضمها من قبل الحزب الديمقراطي النيبالي أنا endonuclease قبل تنقيته من قبل المنتج PCR ، والتي يمكن أن تقلل من الخلفية وزيادة معدل الإيجابية . ومع ذلك ، في ظل الظروف العادية ، بعد إعادة تدوير المطاط كافية للحد من نسبة هذا الناقل غير الخطية إلى انخفاض زوي ، وبالتالي عكس PCR مصدر خطي ناقلات نوصي أيضا إعادة تدوير المطاط .

B: إعداد أجزاء الحمض النووي الإدراج

( 1 ) . المبدأ العام في خطوة واحدة تصميم سلس استنساخ التمهيدي هو أنه من خلال إدخال تسلسل مثلي في نهاية المطاف من خطي استنساخ ناقلات في 5 ' نهاية التمهيدي ، نهاية الإدراج جزء من تضخيم المنتج 5 ' و 3 ' نهاية الإدراج جزء من تضخيم المنتج على التوالي مع تسلسل متطابقة تماما وان المقابلة اثنين من نهايات خطي استنساخ ناقلات ( 16 بي بي 20 بي بي ) .

( 2 ) . إدراج جزء التمهيدي تصميم : استنساخ التمهيدي يتضمن إدراج جزء محدد التمهيدي و تداخل تسلسل .

الاستنساخ إلى الأمام التمهيدي ( 5 ' - 3 ' ) : خطي ناقلات إلى الأمام 16-25 ن المنطقة المتداخلة تسلسل ( 3 ' نهاية العد ) + إدراج جزء إلى الأمام محددة التمهيدي تسلسل ( 18-25 ن )

استنساخ عكس التمهيدي ( 5 ' - 3 ' ) : خطي ناقلات عكس 16-25 NT تداخل المنطقة تسلسل ( 3 ' نهاية تحسب ) + إدراج جزء عكس التمهيدي محددة تسلسل ( 18-25 NT )

ملاحظة : قاعدة قاعدة على الأقل 16 شركة بريتيش بتروليوم في المنطقة المتداخلة ، TM القيم بين المناطق المتداخلة يجب أن تكون متسقة أكثر من 60 درجة مئوية ( في الزوج = 2 درجة مئوية و GC الزوج = 4 درجة مئوية ) ، وإلا فإن قاعدة الأرقام يمكن تمديدها حتى يتم الوفاء بالشروط .

وفقا لهيكل خطي نهاية الناقل ( 5 ' projection 3 ' projection , شقة نهاية ) ، التمهيدي تصميم ينقسم إلى ثلاث حالات ، على النحو التالي :

طرفي خطي ناقلات يمكن أن تكون تعسفية مزيج من اثنين أو أكثر من ثلاثة هياكل المحطة الطرفية بسبب اختلاف طرق خطية ( على سبيل المثال ، واحدة مزدوجة انزيم الهضم ، عكس PCR ) .

عند حساب درجة حرارة التخمير من تضخيم الاشعال ، TM قيمة محددة التضخيم الجيني تسلسل يحتاج فقط إلى حساب .

( 3 ) . اختيار الإنزيمات : عالية الدقة بوليميريز الحمض النووي أو بكر ميكس ينصح ( المادة رقم : p517-05 أو p814-05 ) .

( 4 ) . رد الفعل : عموما وفقا لتعليمات محددة بوليميريز يمكن استخدامها .

( 5 ) . تنقية إدراج جزء

l اختياري : إذا كان جزء يأتي من قالب البلازميد البلازميد المؤتلف ناقلات لها نفس المقاومة ، ثم هضم قالب البلازميد مع الحزب الديمقراطي النيبالي endonuclease قبل تنقية يمكن أن تقلل من الخلفية وزيادة معدل الإيجابية .

l إذا كان جزء واحد ، فمن المستحسن أن تنقية جزء مع بكر المنتج كيت ( رقم dc012-100 ) .

l إذا كان هناك غير محددة التضخيم ، فمن المستحسن استخدام هلام الانتعاش كيت ( رقم dc011-100 ) لاسترداد شظايا .

l إذا كان هناك متطلبات صارمة على موقع انزيم الهضم ، فمن المستحسن أن نولي اهتماما لاختيار موقع انزيم الهضمبين تداخل المنطقة تسلسل تسلسل الجينات الخاصة الإيجابية والسلبية استنساخ التمهيديإضافة قاعدة مفقودة لاستعادة الموقع الأصلي ( انظر المثال التالي ) .

l إذا كانت البلازميدات المؤتلف تستخدم في التعبير عن البروتين ، يجب الحرص على قراءة رمز الإطار ، تسلسل البروتين التعبير وتنقية ( على سبيل المثال ، المروج ، رويال بنك أوف سكوتلاند تسلسل ، رامزة البداية ، إنهاء رامزة ، تسمية البروتين ، وما إلى ذلك ) لا يمكن تدميرها .

أمثلة على تصميم التمهيدي إلى الأمام ( ECOR أنا إنزيم شق ) :

كما هو موضح أعلاه ، الناقل هو مقطوع من قبل ecor-i انزيم لتشكيل 5 ' جاحظ الطرفية :

على أساس مبدأ التصميم أعلاه ، بدءا من 3 ' نهاية ، 16bp-25bp تحسب من الخلف ( على سبيل المثال ، 20 بي بي محطة التداخل نفس تسلسل المستخدمة ) ، ثم تضاف إلى الهدف جزء محدد التمهيدي تسلسل . تأكد من أن TM القيم في منطقة التداخل هي نفسها و هي أكثر من 60 درجة مئوية ( في الزوج = 2 درجة مئوية و GC الزوج = 4 درجة مئوية ) .

التمهيدي محددة على النحو التالي : 'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNN -3'

ملاحظة : بعد الانتهاء من استنساخ الربط التمهيدي أعلاه ، ecor i-enzymic الموقع سوف تختفي .

إذا نحن بحاجة إلى الحفاظ على ecor i-enzymic الموقع ، ونحن بحاجة إلى استكمال اي ecor i-enzymic تسلسل aattc بين 20 بي بي تداخل تسلسل في نهاية الناقل و الهدف جزء محدد التمهيدي تسلسل .

التفاصيل على النحو التالي : 'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNN -3'

أمثلة على عكس التصميم التمهيدي ( هند الثالث شق الأنزيمية ) :

كما هو موضح أعلاه ، الناقل هو مقطوع من قبل هند الثالث انزيم لتشكيل 5 ' جاحظ نهاية :

على أساس مبدأ التصميم أعلاه ، بدءا من 3 ' نهاية ، 16bp-25bp تحسب من الخلف ( على سبيل المثال ، 20 بي بي محطة التداخل نفس تسلسل المستخدمة ) ، ثم تضاف إلى الهدف جزء محدد التمهيدي تسلسل . تأكد من أن TM القيم في منطقة التداخل هي نفسها و هي أكثر من 60 درجة مئوية ( في الزوج = 2 درجة مئوية و GC الزوج = 4 درجة مئوية ) .

عكس التمهيدي محددة على النحو التالي : 'CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNN -3'

ملاحظة : بعد الانتهاء من استنساخ الربط التمهيدي أعلاه ، هند الثالث قطع الموقع سوف تختفي ( لا قطع الموقع محفوظة ) .

إذا نحن بحاجة إلى الحفاظ على هند الثالث الموقع ، ونحن بحاجة إلى استكمال حذف هند الثالث الاعتراف الموقع تسلسل agctt بين 20 بي بي تداخل تسلسل في نهاية الناقل و الهدف جزء محدد التمهيدي تسلسل .

التفاصيل على النحو التالي : 'CTGCCATCGGATCGTTCGCAagctt NNNNNNNNNNNNNNNN -3'

الخطوات التنفيذية سلس استنساخ فعل :

ملاحظة : 2 × onestep كلونينج ميكس يحتوي على ربط محسن ، شماعة لزجة جدا ، وأكثر سمكا عندما تؤخذ من الثلاجة عند درجة حرارة منخفضة ، ويمكن وضعها في راحة اليد المجمدة لبضع دقائق لزيادة درجة الحرارة يمكن أن تقلل من اللزوجة ( لا تؤثر على الجودة ) ، وخفيفة الوزن مزيج متجانس ، وعلى الفور الطرد المركزي جمع أنبوب أسفل .

1. إنشاء نظام رد فعل وفقا للجدول التالي ( يمكن إعدادها في درجة حرارة الغرفة باستخدام PCR أنبوب )

* الناقل يستخدم عادة 20-50 نانوغرام ، النسبة المولية بين إدراج جزء الناقل هو الأمثل بين 2 : 1-3 : 1 ؛ إذا كان إدراج جزء أقل من 200 بي بي ، النسبة المولية بين إدراج جزء والناقل هو 5 : 1 .

2. تخلط جيداً برفق في 50س( ج ) رد فعل لمدة 15 دقيقة ( يمكن أن يؤديها على جهاز PCR ) ، بعد الانتهاء من رد الفعل ، PCR أنبوب يوضع على الجليد مباشرة أو تحويلها إلى - 20سج . أقصر شظايا مثل 100bp-1kb يستغرق سوى 15 دقيقة للحصول على ما يكفي من transformants ، أطول شظايا متصلة ، ويمكن تمديد وقت رد الفعل إلى 60 دقيقة .

3. 5 μ ل رد فعل المنتج هو تحويلها إلى خلايا مستقبلة للضوء مواصفات ( إذا كان هناك عدد أقل من transformants ، جميع المنتجات يمكن تحويلها إلى جميع transformants المغلفة لوحات ) .

تحديد استنساخ إيجابية :

وفقا للظروف الخاصة ، مستعمرة بكر يمكن اختيار تحديد البلازميد ( رقم 31013-100 ) يمكن استخراجها من أجل تحديد endonuclease التقييدية أو التسلسل .

خطوة واحدة seamless تنظيف كيت استنساخ سلس