خطوة واحدة جيبسون تنظيف كيت استنساخ سلس

خطوة واحدة جيبسون استنساخ مجموعة

( يمكن ربط 1-5 شظايا )

خطوة واحدة جيبسون تنظيف كيت استنساخ سلس

رقم الدليل :42112

حزمة / حزمة الكمية :

تخزين المنتجات :-20سCالحفاظ على تجنب تكرار التجميد والذوبان

وصف المنتج : هذا المنتج لا يعتمد علىT4الليباز لا تقتصر على مواقع انزيم الهضم من الناقل و الهدف جزء ، ولكن مباشرة من خلال طريقة التركيب من تداخل جزء ، أي طريقة يمكن أن تكون خطية من الناقل مع انزيم الخاصة الجمع بين اثنين من المحطات الطرفية التي يتم توفيرها مع الليباز .15-25bpتداخل المنطقةالـ PCRشظايا ( شقة ) المنحى إعادة التركيب ، يمكن أن يتحقق بسرعة1-5كفاءة وسلاسة استنساخ اثنين من شظايا .

ميزات المنتج :

1. 30دقيقة واحدة أو أكثر يمكن أن تكون طويلة أو قصيرةالـ PCRتضخيم جزء ( نهاية مسطحة ) تضاف إلى الناقل .

2. توافر مواقع خالية من الناقل و الإدراج شظايا و نهاية مسطحة من الناقلولزج ينتهي يمكن استنساخها في أي موقع .

3.استنساخ سلس ، نقطة الإدراج لن أعرض غير المرغوب فيها قاعدة تسلسل .

4.كفاءة ودقة معدل الإيجابية95%منتدى

إعداد ناقلات الخطية وإدراج شظايا الحمض النووي :

أ : إعداد الناقل الخطي

( 1 ) . مصدر إنزيم الهضم :خطي الناقل التي تم الحصول عليها عن طريق انزيم الهضم يمكن أن تكون إما شقة نهاية أو نهاية لزجة ، واحدة أو مزدوجة enzymolysis enzymolysis ، الغراء يمكن استردادها بعد enzymolysis . . . . . . .

ملاحظة : هناك شركات مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل ليجاسى الحمض النووي في الربط السلس والاستنساخ فعل النظام ، لا يمكن أن يكون الناقل الذاتي ربط رد الفعل . وبناء على ذلك ، حتى لو كان خطي الناقل أعدته إنزيم واحد طريقة الهضم لا تتطلب محطة dephosphorization العلاج . استنساخ إيجابية كاذبة ( أي إدراج جزء ) بعد التحول من المؤتلف المنتج هو تحويلها من قبل nonlinearized حلقة الناقل . ونحن نوصي بأن نسبة غير خطية من الناقلين يمكن تخفيضها إلى انخفاض زوي بعد الأنزيمية الهضم .

( 2 ) . عكس مصدر PCR :نوصي باستخدام عالية الدقة بوليميريز الحمض النووي ( المادة رقم : p517-05 ) إعداد ، إذا كان واحد من التضخيم الشريط يمكن تنقيته من قبل المنتج PCR ( المادة رقم : dc012-100 ) للحصول على الناقل ، وإلا من خلال استعادة الغراء ( المادة رقم : dc011-100 ) للحصول على الناقل .

ملاحظة : بلازميد قالب عكس PCR هو أيضا غير الخطية ناقلات ، والتي قد تؤدي إلى استنساخ إيجابية كاذبة ( أي إدراج جزء ) . ولذلك ، البلازميد قالب يمكن هضمها من قبل الحزب الديمقراطي النيبالي أنا endonuclease قبل تنقيته من قبل المنتج PCR ، والتي يمكن أن تقلل من الخلفية وزيادة معدل الإيجابية . ومع ذلك ، في ظل الظروف العادية ، بعد إعادة تدوير المطاط كافية للحد من نسبة هذا الناقل غير الخطية إلى انخفاض زوي ، وبالتالي عكس PCR مصدر خطي ناقلات نوصي أيضا إعادة تدوير المطاط .

ب : إعداد إدراج أجزاء الحمض النووي

( 1 ) . تصميم واحد إدراج جزء استنساخ التمهيدي : استنساخ التمهيدي يتضمن إدراج جزء محدد التمهيدي و تداخل تسلسل .

الاستنساخ إلى الأمام التمهيدي ( 5 ' - 3 ' ) : خطي ناقلات إلى الأمام 16-25 ن المنطقة المتداخلة تسلسل ( 3 ' نهاية العد ) + إدراج جزء إلى الأمام محددة التمهيدي تسلسل ( 18-25 ن )

استنساخ عكس التمهيدي ( 5 ' - 3 ' ) : خطي ناقلات عكس 16-25 NT تداخل المنطقة تسلسل ( 3 ' نهاية تحسب ) + إدراج جزء عكس التمهيدي محددة تسلسل ( 18-25 NT )

ملاحظةقاعدة عدد من تداخل المناطق على الأقل 16 بي بي ، TM القيم بين تداخل المناطق يجب أن تكون متسقة أكثر من 60 درجة مئوية ( في الزوج = 2 درجة مئوية GC الزوج = 4 درجة مئوية ) ، وإلا فإن عدد القواعد يمكن تمديدها حتى يتم الوفاء بالشروط .

وفقا لهيكل خطي نهاية الناقل ( 5 ' projection 3 ' projection , شقة نهاية ) ، التمهيدي تصميم ينقسم إلى ثلاث حالات .

طرفي خطي ناقلات يمكن أن تكون تعسفية مزيج من اثنين أو أكثر من ثلاثة هياكل المحطة الطرفية بسبب اختلاف طرق خطية ( على سبيل المثال ، واحدة مزدوجة انزيم الهضم ، عكس PCR ) .

عند حساب درجة حرارة التخمير من تضخيم الاشعال ، TM قيمة محددة التضخيم الجيني تسلسل يحتاج فقط إلى حساب .

على أساس مبدأ التصميم أعلاه ، بدءا من 3 ' نهاية ، 16bp-25bp تحسب من الخلف ( على سبيل المثال ، 20 بي بي محطة التداخل نفس تسلسل المستخدمة ) ، ثم تضاف إلى الهدف جزء محدد التمهيدي تسلسل . تأكد من أن TM القيم في منطقة التداخل هي نفسها و هي أكثر من 60 درجة مئوية ( في الزوج = 2 درجة مئوية و GC الزوج = 4 درجة مئوية ) .

التمهيدي إيجابية محددة على النحو التالي : 5 'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNN 3'

ملاحظة : بعد الانتهاء من استنساخ الربط التمهيدي أعلاه ، ecor-i الموقع سوف تختفي .

إذا لزم الأمر الاحتفاظ ECOR أنا الموقع يحتاج إلى تكملة اي ECOR أنا موقع الاعتراف aattc بين 20 بي بي تداخل تسلسل في نهاية الناقل و الهدف جزء محدد التمهيدي تسلسل .بعد الانتهاء من استنساخ الربط ، ecor-i الموقع لا يزال قائما .

على وجه التحديد على النحو التالي : 5 'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCG aattc NNNNNNNNNNNNNNNN 3'

الناقل هو مقطوع من قبل هند الثالث انزيم لتشكيل 5 ' جاحظ ينتهي :

على أساس مبدأ التصميم أعلاه ، بدءا من 3 ' نهاية ، 16bp-25bp تحسب من الخلف ( على سبيل المثال ، 20 بي بي محطة التداخل نفس تسلسل المستخدمة ) ، ثم تضاف إلى الهدف جزء محدد التمهيدي تسلسل . تأكد من أن TM القيم في منطقة التداخل هي نفسها و هي أكثر من 60 درجة مئوية ( في الزوج = 2 درجة مئوية و GC الزوج = 4 درجة مئوية ) .

عكس التمهيدي على النحو التالي : 5CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNN 3'

ملاحظة : بعد الانتهاء من استنساخ الربط التمهيدي أعلاه ، هند الثالث قطع الموقع سوف تختفي ( لا قطع الموقع محفوظة ) .

إذا لزم الأمر الاحتفاظ الهدف من هذه الدراسة هو استكشاف العلاقة بين 20 بي بي تداخل تسلسل في نهاية الناقل و الهدف جزء محدد التمهيدي تسلسل . ，هند الثالث موقع لا تزال موجودة ( الحفاظ على الموقع ) .

على وجه التحديد على النحو التالي : 5 'CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNN 3'

( 2 ) . استنساخ التمهيدي تصميم عدة إدراج شظايا : إدراج جزء التمهيدي طريقة التصميم التي ترتبط مع طرفي الناقل هو نفس طريقة تصميم جزء واحد

* اثنين من الأساليب المذكورة أعلاه * علامات ( الأزرق والأحمر ) مصممة على تداخل المناطق بين تعدد إدراج شرائح ، أي واحد أو اثنين من الأساليب التي يمكن اختيارها في تصميم متعدد جزء التمهيدي ، وبالتالي ضمان أن هناك تداخل المناطق 15-25bp بين شرائح .

( 3 ) . اختيار الإنزيمات : عالية الدقة بوليميريز الحمض النووي أو بكر ميكس ينصح ( المادة رقم : p517-05 أو p814-05 ) .

( 4 ) . رد الفعل : عموما وفقا لتعليمات محددة بوليميريز يمكن استخدامها .

( 5 ) . تنقية إدراج جزء

lاختياريإذا كان جزء يأتي من قالب البلازميد ، البلازميد المؤتلف ناقلات لها نفس المقاومة ، ثم هضم قالب البلازميد مع الحزب الديمقراطي النيبالي أنا endonuclease قبل تنقية يمكن أن تقلل من الخلفية وزيادة معدل الإيجابية .

lإذا كان جزء واحد ، فمن المستحسن أن تنقية جزء مع بكر المنتج كيت ( البند رقم 43012-100 ) .

لإذا كان هناك غير محددة التضخيم ، فمن المستحسن استخدام هلام الانتعاش كيت ( رقم 43011-100 ) لاسترداد شظايا .

لمن خلال هذا الأسلوب ، مواقع قطع خطي ناقلات يمكن حذفها عند الربط . الانتباه إلى اختيار موقع إنزيم الهضمبين تداخل المنطقة تسلسل تسلسل الجينات الخاصة الإيجابية والسلبية استنساخ التمهيديحذف قاعدة تضاف إلى استعادة الموقع الأصلي ( انظر مثال على عكس التمهيدي تصميم ) .

لإذا كانت البلازميدات المؤتلف تستخدم في التعبير عن البروتين ، يجب الحرص على قراءة رمز الإطار ، تسلسل البروتين التعبير وتنقية ( على سبيل المثال ، المروج ، رويال بنك أوف سكوتلاند تسلسل ، رامزة البداية ، إنهاء رامزة ، تسمية البروتين ، وما إلى ذلك ) لا يمكن تدميرها .

الخطوات التنفيذية سلس استنساخ فعل :

ملاحظة : 2 * Cloning ماستر ميكس يحتوي على ربط محسن ، شماعة لزجة جدا ، وأكثر سمكا عندما تؤخذ من الثلاجة عند درجة حرارة منخفضة ، ويمكن وضعها في راحة اليد المجمدة لبضع دقائق لزيادة درجة الحرارة ، ويمكن أن تقلل من اللزوجة ( لا تؤثر على الجودة ) ، الاصبعبو يضرب الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي تماما أو حتى خلط دوامة التذبذب .

1. إنشاء نظام رد فعل وفقا للجدول التالي ( يمكن إعدادها في درجة حرارة الغرفة باستخدام PCR أنبوب )

* الناقل يستخدم عادة 10-50 نانوغرام ، النسبة المولية بين إدراج جزء الناقل هو الأمثل بين 2 : 1-3 : 1 ؛ إذا كان إدراج جزء أقل من 200 بي بي ، النسبة المولية بين إدراج جزء والناقل هو 5 : 1 ، في حين أن نسبة المولي بين إدراج جزء و جزء هو 1 : 1 .

2. تخلط جيداً برفق في 50س( ج ) رد فعل لمدة 15 دقيقة ( يمكن أن يؤديها على جهاز PCR ) ، بعد الانتهاء من رد الفعل ، PCR أنبوب يوضع على الجليد مباشرة أو تحويلها إلى - 20سج - ربط أكثر من 3 أجزاء ، ويمكن تمديد وقت رد الفعل إلى 30 دقيقة .

3. 5 μ ل رد فعل المنتج هو تحويلها إلى خلايا مستقبلة للضوء مواصفات ( إذا كان هناك عدد أقل من transformants ، جميع المنتجات يمكن تحويلها إلى جميع transformants المغلفة لوحات ) .

تحديد استنساخ إيجابية :

وفقا للظروف الخاصة ، مستعمرة بكر يمكن اختيار تحديد البلازميد ( رقم 31011-100 ) يمكن استخراجها من أجل تحديد endonuclease التقييدية أو التسلسل .

خطوة واحدة جيبسون تنظيف كيت استنساخ سلس