بلاو تي ناقلات استنساخ كيت T4

نوربولدبلاو تي ناقلات استنساخ كيت T4

pblue-t ناقلات استنساخ كيت

رقم الدليل : 42014

تكوين مجموعات التخزين والاستقرار :

- 20 ℃ التخزين ، 6 أشهر لا تؤثر على استخدام النتائج .

معايير محددة من المنتجات تخضع المعايير الواردة في مواصفات المنتج

منتوج عرض :

العديد من المنتجات PCR التضخيم مثل طق بوليميريز الحمض النووي ، TH بوليميريز الحمض النووي ، الخ .-هناك قاعدة بارزة في الجزء الخلفي من المحطة الطرفية ، بحيث يمكن استخدام المنتج PCR 3-ناقلات مع جاحظ قاعدة تي خلف محطة استنساخ بسهولة . إن pblue-t ناقلات تم الحصول عليها من pbluescript الثاني كورونا ( + ) البلازميد ، تسلسل مناسب أضيفت إلى موقع ecori الهضم ، و 3 ' محطة من ناقلات pblue-t تم هضمها من قبل xcmi لإنتاج غير تزاوج تي قاعدة مباشرة ، وبالتالي تحسين كفاءة المؤتلف . اثنين من المواقع التي تم تصميمها من قبل اثنين من ecor أنا فقط تي في كلا نهايات من pblue-t ناقلات الإدراج الموقع يمكن الكشف عنها بواسطة انزيم الهضم مع انخفاض التكلفة وعالية الكفاءة . وفي الوقت نفسه ، pblue-t ناقلات لا تحتوي على ndei أو ncoi تقييد endonuclease الموقع ، والتي يمكن استخدامها بسهولة استنساخ الجينات التي تحتوي على الموقع المذكور أعلاه . وبالإضافة إلى ذلك ، فإن الشركة الناقل نظام الاتصال لديها أيضا خلفية منخفضة ( أقل من 10 في المائة من البقع الزرقاء ) ، وارتفاع معدل إعادة التركيب ( أكثر من 90 ٪ من البقع البيضاء هناك إدراج أجزاء ) ، يمكن أن تكون مرتبطة بسرعة ، وهلم جرا . البيانات التقنية ذات الصلة من pblue-t ناقلات مدرجة في نهاية هذه المواصفات ، و تسلسل كامل يمكن الرجوع إلى pbluescript الثاني كورونا ( + ) تسلسل ، ولكن تسلسل في موقع polyclone الهضم يختلف قليلا .

T3 ، T7 المروج التمهيدي و M13 العالمي التمهيدي يمكن استخدامها في تسلسل

خطوات التشغيل :

1. إعداد ردود الاتصال :

إذا كان المنتج PCR هو تنقية أو لا يعتمد على نوعية المنتج PCR التضخيم . إذا كان المنتج PCR نظيفة جدا ، يمكن أن تكون مرتبطة مباشرة دون تنقية . ومع ذلك ، إذا كان المنتج PCR باستخدام البلازميد كقالب ، ثم يجب تنقيته . PCRالمنتج يمكن أن تكون مفصولة الاغاروز الكهربائي الهلامي . هذه الشركة تنتج منتجات الحمض النووي تنقية سريعة الانتعاش كيتالحمض النووي شظايا أكثر من 0 بي بي يمكن استردادها .

بكر المنتجات التي تم تضخيمها من قبل طق ، ث ، amplitaq و klentaq بوليميريز الحمض النووي ، مع تسليط الضوء على 3-Aمنتدى امتلكس-بكر المنتجات في محطة يمكن أن تكون مرتبطة مباشرة مع pblue-t ناقلات . مع®5 ' exoenzyme النشاط بوليميريز الحمض النووي ( عالية الدقة انزيم ) تضخيم PCR المنتجات المسطحة ، استنساخ هذه المنتجات المسطحة ، ينبغي أن تكون جيدة في خط 3-نهاية زائد العمل .

2. ردود الفعل المشتركة :

1 ) في معيار واحدmالانضمام إلى نظام رد فعلmل3pblue-t 0 ٪الناقل Xmل PCRفي ظل الظروف العادية ، ليس من الضروريالـ PCRعموما النسبة المولية بين المنتج و الناقل PCR الأمثل إلى 2 : 1 ~ 10 : 1 ، نتائج جيدة يمكن الحصول عليها .1ml 10لاربط العازلو 0.5-1mل(T4 الحمض النووي 2.5-5 وحدات فايسLigase， المياه المتبقية . ويتم الرد وفقا للنظم التالية :

عموما ، T4 الحمض النووي ليغاس تضاف في نهاية المطاف .

2 ) الاتصال بين عشية وضحاها في 16 ℃ ( عادة ما يمكن أن تكتمل في جهاز PCR ) .

يوصى عادة 16 درجة مئوية للاتصال بين عشية وضحاهاmlمعيار نظام ليجاسىوحدات وايسيمكنك الحصول على معظم transformers . . . . . . . ومع ذلك ، هذا النظام يحتوي على شماعة enhancer يمكن تحسين كفاءة الاتصال عدة مرات，في حالة ارتفاع كمية ليغازmlأوصى نظام ليجاسىوحدات وايسالاتصال في 16 ℃ لمدة 30 دقيقة يمكن أن تلبي متطلبات الدراسة العامة .

( 3 )تبريد الجليد ، ثم تحويلها أو تخزينها في - 20 ℃ . . . . . . .

3. اتصال سريع رد :

1 ) تتم الاستجابة وفقا للنظم التالية :

عموما ، T4 الحمض النووي ليغاس تضاف في نهاية المطاف .

2 ) 22 ℃ الاتصال لمدة 5-10 دقائق ( عادة ما يمكن أن تكتمل في جهاز PCR ) .

2 لاقائمة سريعة عازلة يحتوي بالفعل على جميع المكونات الأمثل اتصال سريع ، وعادة ما يوصى 22 درجة مئوية لمدة 10 دقائق .( 10 )mlنظام ليجاسىوحدات وايسيمكن أن تمتد إلى 30 دقيقة ) عموما الحصول على نتائج مرضية . وبالإضافة إلى ذلك ، يمكن للنظام أيضا أن تكون متصلا في 16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقةmlنظام ليجاسىويس الوحدات ) يمكن أن تلبي متطلبات البحث العام .

( 3 )تبريد الجليد ، ثم تحويلها أو تخزينها في - 20 ℃ . . . . . . .

4. تحويل

ديدو50-100mل الخلايا المستقبلة ، وضعت على الجليد ، بعد quan مذاب ، خفقت عدة مرات لتعليق الخلايا بالتساوي .

ديدوإضافة 4-5mlالانضمام إلى الحل ( الحد الأقصى يمكن أن تضاف ، طالما أن حجم لا يتجاوز 1 / 10 من حجم الخلايا المستقبلة ) ، بلطف مزيج . وضع على الجليدثلاثون دقيقة 42 ℃ حمام الماء الصدمة الحرارية 90ثانية . وضع على الجليد3 دقائق

ديدوزائد00mل رطل أو شركة نفط الجنوب متوسطة ( بدون المضادات الحيوية ) ، 37 ℃ 150 دورة في الدقيقةتتأرجح الثقافة لمدة 60 دقيقة .

ديدولmlالبكتيريا المغلفة قبل استخدام 16mل 50 ملغ / مل IPTGوmل 20 مغ / مل x-gal المغلفة على أمبير تشينغ .

إذا كان من المتوقع أن يكون هناك عدد أقل من استنساخ ، يمكن إزالة جزء من الثقافة المتوسطة عن طريق الطرد المركزي ( 4 ، 000 دورة في الدقيقة ، 2 دقيقة ) ، وترك كمية مناسبة من الثقافة المتوسطة تعليق ، ثم تأخذ كل أو كمية مناسبة من الطلاء على لوحة مسطحة ( طلاء السائل المتبقي من البكتيريا يمكن تخزينها في 4 درجات ، في اليوم الثاني إذا كان عدد من تحويل مستعمرة صغيرة ، يمكن أن تكون جميع البكتيريا المتبقية المغلفة مع ثقافة جديدة لوحة ) .

ديدولوحة وضعت بشكل إيجابي في 37 ℃ لمدة 1 ساعة لاستيعاب الكثير من السوائل ، ثم مقلوب الثقافة بين عشية وضحاها .
5 . الفرز :

1 . الأزرق والأبيض فحص ترانسبوزونات :

عندما يتم إدراج الحمض النووي الشظايا الخارجية في pblue-tبسبب الخارجيةوجود تسلسل الحمض النووي يغير الترميز لاك زد الجينات .ب -جالاكتوسيداسيأ -ولذلك ، المؤتلف استنساخ يظهر اللون الأبيض على x-gal / IPTG لوحة ، ولكن ليس اللون الأزرق . في بعض الأحيانإدراج جزء لا يؤثرlacz جين يقرأ رمز الإطار ، أو إدراج جزء صغير جدا ، في هذه الحالة مستعمرة ( المؤتلف استنساخ ) يظهر الضوء الأزرق أو في مركز مستعمرة تظهر بقعة زرقاء شاحبة ، خارج دائرة بيضاء ( عين السمكة مثل سمك السلور العين ) . أبيض أو أزرق شاحب المستعمرات التي نمت على iptg / x-gal لوحة تم اختيارهم من قبل المسواك إلى متوسطة تحتوي على أمبير تشينغ mycin ، ومثقف في 37 ℃ بين عشية وضحاها .
2 . تحديد ترانسبوزونات :

أ.البلازميد المستخرج من السائل البكتيرية مثقف مستعمرة بيضاء ، كان مقطوع من قبل ecor أنا أو غيرها من الانزيمات المناسبة ، وحجم جزء تم فحصها من قبل الاغاروز الكهربائي الهلامي لتحديد ما إذا كان الهدف جزء موجود .

ب.اختيار المستعمرات البيضاء مباشرة عن طريق الاسترداد ( انظر النسخة 3 من الاستنساخ الجزيئي أو استشارة لنا )

ج - تحديد ما إذا كان أو لم يكن هناك استنساخ الهدف باستخدام التمهيدي T3 و T7 المروج أو مناسبة أخرى التمهيدي التسلسل .

كيفية حساب الكمية المطلوبة من المنتجات PCR في ربط رد الفعل ؟

عموما النسبة المولية بين المنتج و الناقل PCR الأمثل 2 : 1 ~ 10 : 1 ( التوصية 3 : 1 ) للحصول على نتائج جيدة .

على سبيل المثال ، فإن النسبة المولية من إدراج جزء من الناقل إلى الناقل هو 3 : 1 ، على سبيل المثال ، إذا كان الناقل هو 40 نانوغرام في ربط رد الفعل ، إدراج جزء من حجم 1000 بي بي ، ثم إدراج جزء من كمية من [ 40 نانوغرام الناقل × 1 كيلوبايت إدراج جزء من 2.984 نانوغرام / 1 = 40.3 نانوغرام .

بلاو تي ناقلات استنساخ كيت T4