إليسا عدة مستقبلات انترلوكين 6 ( IL - 6 ) يمكن استخدامها لتحديد IL - 6 المستقبلات في عينات من مصل الدم .
مستقبلات انترلوكين 6 إليسا كيت
مستقبلات انترلوكين 6 إليسا كيتهو أداة تستخدم في الكشف عن كمية IL - 6 المستقبلات في العينات البيولوجية . il-6r يلعب دورا رئيسيا في تنظيم المناعة و الاستجابة الالتهابية .
مبدأ الكشفطرق : مزدوجة ساندويتش انزيم مرتبط المناعي فحص الأجسام المضادة المستخدمة في عدة . الأجسام المضادة المحددة ضد il-6r قبل المغلفة على انزيم مرتبط لوحة . بعد إضافة العينة ، il-6r في عينة محددة ملزمة مع الأجسام المضادة الصلبة . ثم ، انزيم المسمى anti-il-6r الضد هو إضافة إلى تشكيل " الأجسام المضادة الصلبة il-6r-enzymic المسمى الضد " معقدة مع il-6r ملزمة على الأجسام المضادة الصلبة . بعد ما يكفي من الغسيل لإزالة المواد غير الملزمة ، الركيزة الحل ( على سبيل المثال ، TMB ) أضيفت إلى الركيزة تحت حفز الانزيم ، رد فعل اللون يحدث . تركيز il-6r في العينة التي تم الحصول عليها من خلال قياس الامتصاصية في الطول الموجي محددة ( عادة 450nm ) مع انزيم المسمى الصك .
تكوين عدة
انزيم مرتبط لوحة: 96 أو 48 المسام ، والتي كانت قبل المغلفة مع الأجسام المضادة ضد il-6r ، هو الناقل من رد الفعل .
معيار المنتجالعام : تجميد المجفف المنتجات ، وهناك 2 زجاجات . قبل الاستخدام ، من الضروري إعادة حل مع معيار المخفف ، تمييع في تركيزات مختلفة من التدرج ، مثل 0 ، 31.2 ، 62.5 ، 125 ، 250 ، 500 ، 1000 بيكوغرام / مل ، وما إلى ذلك ، من أجل رسم منحنى القياسية .
عينة الحادي عشر الإصدارتستخدم في تمييع العينة التي هي عالية جدا في التركيز ، والتأكد من أن تركيز العينة في الكشف عن مجموعة من مجموعات .
انزيم المسمى الضدوهي HRP المسمى anti-il-6r الضد ، هو تركيز السائل ، عند الاستخدام ، يجب أن تكون مخففة مع انزيم المسمى الضد المخفف .
الأجسام المضادة انزيم المسمى الحادي عشر الإصدار: خصوصا لأنّ تمييع انزيم المسمى الأجسام المضادة .
الركيزة الحلعلى سبيل المثال ، TMB الركيزة يمكن أن تتفاعل مع HRP في انزيم المسمى الأجسام المضادة ، مما أدى إلى تغيير اللون .
سائل الغسيلعادة ما تكون مركزة ، تحتاج إلى استخدام الماء المقطر أو منزوع الأيونات الماء بالتناسب المخفف ، غسل انزيم مرتبط لوحة ، وإزالة المواد غير الملزمة ، والحد من خلفية التدخل .
إنهاء السائلأكثر من حمض قوي الحل ( مثل حامض الكبريتيك ) المستخدمة في إنهاء الركيزة لون رد فعل ، حتى أن رد فعل السائل اللون مستقرة وسهلة القراءة .
لوحة ختم الفيلمفائدة نموذج يستخدم لتغطية انزيم ربط لوحة في عملية الاحتباس الحراري لمنع تبخر السائل والتلوث الخارجي .
دليل الاستخدامطرق الاستخدام ، والمسائل التي تحتاج الى اهتمام ، مؤشرات الأداء ، وما إلى ذلك من عدة عرض بالتفصيل .
متطلبات العينة
سيرومبعد جمع الدم ، وضعت في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة أو 4 ℃ بين عشية وضحاها ، ثم طرد مع 1000 × ز لمدة 20 دقيقة . جمع الدم يجب أن تكون خالية من المواد المسببة للحمى و الذيفان الداخلي .
البلازمايمكن استخدام الإيثيلين ديامينى حمض الخليك ( EDTA ) ، الهيبارين ، مثل مضادات التخثر . في غضون 30 دقيقة بعد أخذ العينات ، الطرد المركزي في 2-8 ℃ 1000 × ز لمدة 15 دقيقة .
خلية ثقافة طافالخلايا المستزرعة supernatants كانت centrifuged بواسطة 1000 * ز لمدة 20 دقيقة بعد إزالة الحطام والشوائب .
نسيج متجانسغسل الأنسجة مع precooled الفوسفات العازلة ( برنامج تلفزيوني ، 0.01m ، الرقم الهيدروجيني = 7-4 ) لإزالة بقايا الدم . بعد قطع ، إضافة برنامج تلفزيوني في حوالي 1 : 9 ( ث / ت ) نسبة ، وطحن تماما على الجليد . بعد 5-10 دقائق من 5000 * ز الطرد المركزي ، طاف يؤخذ اختبار .
بعد أخذ العينات ، إذا كان الكشف في وقت قصير ، يمكن تخزينها في 4 ℃ ؛ إذا كان يحتاج إلى وقت طويل للحفاظ على ، تحتاج إلى أن توضع في - 20 ℃ أو - 80 ℃ التجميد والذوبان ، وتجنب تكرار التجميد والذوبان ، انحلال الدم عينة ليست مناسبة للكشف .
عملية تدفق
الأعمال التحضيريةإزالة عدة من الثلاجة قبل 30 دقيقة إلى درجة حرارة الغرفة . وفي الوقت نفسه ، تتركز غسل السائل المخفف مع الماء المقطر أو منزوع الأيونات الماء حسب النسبة المطلوبة .
إضافة عينةمجموعة فارغة ثقب ، ثقب عينة القياسية . عينة الحادي عشر الافراج عن السائل أضيفت إلى ثقب فارغ ، تركيز مختلفة من المواد القياسية أضيفت إلى ثقب القياسية ، وتجهيز العينات أضيفت إلى ثقب العينة ، وكمية من العينات عادة 100
غسلبعد الانتهاء من الحارة ، والتخلص من السائل في حفرة ، ملء كل حفرة مع سائل الغسيل ، نقع في 1-2 دقيقة ثم تجف ، كرر الغسيل 5 مرات ، تأكد من أن che-bottom غسلها بدون مواد لاصقة .
إضافة انزيم المسمى الضدإضافة 100 ميكرولتر في كل مسام و تمييع الأجسام المضادة enzymic المسمى حل العمل لمدة 60 دقيقة في 37 ℃ . . . . . . .
غسل مرة أخرىكرر الخطوات المذكورة أعلاه .
وضع اللونإضافة 90 μ ل الركيزة الحل في كل مسام ، مزيج لطيف ، وتجنب الضوء في 37 ℃ لمدة 15-30 دقيقة ( حسب اللون الفعلي الحكم ) .
إنهاء الردإضافة 50 μ ل إنهاء الحل في كل حفرة ، تغيير لون الحل من الأزرق إلى الأصفر .
قراءاتالامتصاصية ( التطوير التنظيمي ) من كل ثقب تم قياسها في 450nm الطول الموجي مع انزيم المسمى الصك في غضون 15 دقيقة بعد إضافة إنهاء الحل .
حساب النتائجرسم المنحنى القياسي مع تركيز المواد القياسية الإحداثي السيني و التطوير التنظيمي قيمة الإحداثي الطولي . إذا كانت العينة مخففة ، يجب أن تتضاعف في المقابل تخفيف متعددة ، وبالتالي الحصول على التركيز الفعلي .
مؤشرات الأداء
كشف مدىهناك بعض الاختلافات بين مجموعات مختلفة ، مجموعة مشتركة من 31.2-2000 بيكوغرام / مل ، والتي يمكن أن تلبي متطلبات الكشف عن il-6r المحتوى في العديد من العينات .
حساسيةيمكن أن تكون منخفضة مثل 15.6 بيكوغرام / مل أو أقل ، ويمكن الكشف عن أثر il-6r في العينة .
خصوصية: il-6r محددة للغاية ، مع مستقبلات السيتوكينات وغيرها من المواد تقريبا أي رد فعل الصليب .
تكرارمعامل الاختلاف في لوحة أقل من 10 ٪ ، معامل الاختلاف بين لوحات أقل من 15 ٪ ، والتي تضمن الاستقرار والموثوقية من نتائج الاختبار .
ملاحظة
تعمل بدقة وفقا للتعليمات ، الكواشف في دفعات مختلفة من مجموعات لا يمكن أن تكون مختلطة .
استخدام المتاح شفط لمنع التلوث الصليب ، إضافة عينة يجب أن تكون دقيقة .
غسل كامل هو المفتاح لضمان دقة النتائج ، لوحة الغسيل لا مخبأ أسفل يؤدي بسهولة إلى نتائج إيجابية كاذبة .
الركيزة الحل حساس للضوء ، تحتاج إلى تجنب الضوء والحفاظ على استخدام اللون رد فعل يجب أن تتم في ظل حالة من الضوء .
وقف السائل للتآكل ، وإيلاء الاهتمام إلى الحماية أثناء العملية ، وتجنب الاتصال مع الجلد والعينين .
من أجل تحسين دقة النتائج ، فمن المستحسن أن جميع العينات القياسية ينبغي أن يتم الكشف عن ثقب مزدوج . كاشف عدة تستخدم فقط لأغراض البحث العلمي و لا يمكن استخدامها في التشخيص السريري .
