خدمة إعداد الأجسام المضادة بولكلونل

خدمة إعداد الأجسام المضادة بولكلونل

عملية إعداد الأجسام المضادة بولكلونل : إعداد المستضد - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

الخطوات التجريبية هي كما يلي :

إعداد الأرنب

اثنين من الأرانب النيوزيلندية البيضاء صحية 6 أسابيع الحجم ( حوالي 2 كجم ) تم اختيارهم للتكيف مع البيئة المعيشية الجديدة ، على الأقل بضعة أيام قبل أخذ عينات من الدم ، الدم ( إشارة سلبية )

1-1 بعناية وضع الأرانب في رفوف ثابتة ، حتى أن الأرانب هادئة ؛

1-2 بعناية إزالة الشعر من آذان الأرانب لجعل الأوعية الدموية واضحة للعيان ( أو لا يحلق ) ؛

1-3 إذا لزم الأمر ، يمكن استخدام كرات القطن الصغيرة مع الكحول لطخة الأوعية الدموية في الأوعية الدموية إلى توسيع الموقع ؛

1-4 حوالي 10 مل من الدم ( حوالي 5 مل من مصل الدم ) مأخوذة من الوريد الأذني بواسطة حقنة .

1-5 سحب الإبرة بعناية ، اضغط على الجرح بشكل صحيح لتجنب النزيف ، ثم استخدام الكحول القطن الكرة لتعقيم الجرح .

1-6 جمع الدم المعطل في 37 ج لمدة 30 دقيقة ، ثم وضعت في 4 ' ج بين عشية وضحاها إلى تجلط الدم والإفراج عن المصل .

1.7 سوف تخثر الدم في 10000r / min الطرد المركزي لمدة 10 دقائق ؛ جمع طاف ، وهذا هو ، المصل .

أرنب الحصانة

2-1 حقن اثنين من الأرانب مع مستضد هو 1 مل ، مستضد حل العازلة يجب أن لا تحتوي على المواد الكيميائية الضارة على الأرانب كل أرنب أول التحصين 400ug مستضد هو أكثر ملاءمة ، ويمكن أيضا أن تكون مناسبة للحد من الحصول على نتائج أفضل ، بعد التحصين يمكن 100ug في كل مرة .

2-2 1 م * فرويند مساعد و إعداد 1 م مستضد مختلطة تماما ، أبيض حليبي . ( أ )

2-3 بعناية إزالة الأرانب من القفص ، أرنب النسيج الحصانة في أربعة أجزاء ( الظهر والفخذ الجذر يمكن أن يكون ) ، كل جزء من 250ul ، إبرة بزاوية 45 درجة تضاف تحت الجلد 1-2cm ، بعد الحقن ، البقاء لبضع ثوان لمنع تدفق مستضد .

2-4 الأرانب تحصين لمدة 20 يوما ، 7-10 أيام بعد تحصين الدم ( بما في ذلك اختبار منتصف الطريق و الدم النهائي ) ، ما مجموعه 4-5 مرات .

3 . اختبار التكافؤ

3-1 اثنين من المراجع السلبية كانت تستخدم في مصل الدم قبل أخذ العينات ، كل منهم كان مخفف مع التركيز الأولي ( مغلقة مخفف ) . إشارة إيجابية

إيجابية المصل

3-2 100ul ، 1ug / م مستضد أضيفت إلى 96 لوحة المسام بين عشية وضحاها في 49 درجة مئوية أو احتضان لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية .

3-3 إسقاط مستضد الحل ، إضافة 200 ش ختم الحل في كل حفرة ، احتضان 49c بين عشية وضحاها أو 379c لمدة 2 ساعة .

3-4 صب ختم السائل ، بات على ورقة ماصة قدر الإمكان لامتصاص السائل المتبقية ، مع غسل السائل غسل المجلس ثلاث مرات في كل مرة قدر الإمكان بات بقايا السائل الجاف ، إذا كان ينبغي أن يوضع لفترة من الوقت ، 37 درجة مئوية الجافة مختومة مع حقيبة مختومة في 20 درجة مئوية للتخزين .

3.5 اتخاذ حزمة لحاف مع لوحة 96 حفرة جيدة ،第---إشارة سلبية السائل 100ul أضيفت إلى المسام ، إشارة إيجابية السائل 100ul أضيفت إلى المسام الثانية ، مصل مضاد 1 : 500 أضيفت إلى المسام الثالثة ، ثم كل المسام كانت مخففة عدة مرات على هذا الأساس ، احتضنت في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة .

3-6 صب السائل ، وغسل لوحة مع سائل الغسيل ثلاث مرات ، بات الجافة . 100 ش HRP المسمى الماوس المضادة أرنب LGG ( 1 : 2000 تمييع ) أضيفت إلى كل حفرة و حضنت في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة .

3-7 صب السائل ، وغسل لوحة مع سائل الغسيل ثلاث مرات ، بات الجافة . 100 ش TMB الركيزة ( سيغما TMB ) أضيفت إلى كل حفرة لمدة 5-20 دقيقة في 37 درجة مئوية ( اعتمادا على عمق اللون ) .

3-8 50u إنهاء الحل ( 2N H2SO4 ) أضيفت إلى كل حفرة ، و قيمة امتصاص الضوء في 450nm الطول الموجي هو قراءة على انزيم العلامات الصك .

بعد الكشف عن الأجسام المضادة التتر تصل إلى أكثر من 1 مليون دولار ، الأرانب يمكن أن تنزف في نهاية المطاف .

تنقية الأجسام المضادة

4 - إعداد الأجسام المضادة تقارب تقارب العمود

4-1 الاغاروز هلام 1 ملغ من cnbr-sepherose 4B أضيفت إلى 2 مول / لتر من حمض الهيدروكلوريك ، و 4 ' ج بين عشية وضحاها ، مما يجعل من الممكن الحصول على 3 م تورم هلام .

4-2 هلام تم نقلها إلى تنقية العمود ، وغسلها مع حوالي 20 مل 2 مول / لتر من حمض الهيدروكلوريك لمدة 3 مرات .

4-3 غسل المتوسطة مع اقتران العازلة -- مرة أخرى ، لأن تفعيل مجموعة من السهل أن تحلل في اقتران العازلة الرقم الهيدروجيني ، هذه الخطوةفي غضون دقائق .

4-4 إضافة 5-10mg مستضد حل في 5 مل اقتران العازلة في جل

4-5 يهز برفق لمدة 2-4 ساعات في درجة حرارة الغرفة ، أو بين عشية وضحاها في 4 ' C . إذا كان المطلوب تحديد كفاءة ملزمة ، تأخذ كمية صغيرة من الحل بعد هذه الخطوة . يغسل المتوسطة مرة واحدة مع 20 مل من اقتران العازلة .

4-6 احتضان لمدة 2 ساعة أو 4 ' ج بين عشية وضحاها مع 15 م 1 ٪ جيش صرب البوسنة الحل في درجة حرارة الغرفة .

4-7 غسل المتوسطة مع الفوسفات العازلة أكثر من 3 مرات ، في كل مرة أكثر من 15 متر ح .

4-8 مستضد يجمد ، ويمكن استخدامها لتنقية .

4-9 إذا لم تستخدم على الفور أو بعد استخدامها ، مع 20 ٪ من الإيثانول مختومة .

5 - تنقية وحفظ الأمصال المضادة

5-1 الأمصال كانت مخففة مع برنامج تلفزيوني isovolume ، الطرد المركزي من 5000-10000 / دقيقة لمدة 15 دقيقة .

5-2 تنظيف مستضد تقارب العمود مع 10 مرات حجم برنامج تلفزيوني لتحقيق التوازن بين العمود .

5-3 إضافة 10 أمتار من المصل المضاد المخفف إلى توازن العمود .

يهز المزيج بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-4 ساعات ، أو 4 ' C بين عشية وضحاها

5-5 غسل مستضد العمود مع 10 مرات حجم برنامج تلفزيوني لإزالة البروتينات الأجنبية ملزمة العمود

5-6 غسل العمود مع ضعف حجم الأجسام المضادة eluent للحصول على الأجسام المضادة المحددة

5-7 استخدام 10 مرات حجم برنامج تلفزيوني عمود التوازن

5-8 ختم العمود مع 20 ٪ من الكحول و 4 ' ج .

بعد الحصول على الأجسام المضادة مزال ، تركيز السكروز أو polyethyleneglycol ثم دياليزيد الملح في برنامج تلفزيوني ، التطوير التنظيمي قيمة الأجسام المضادة في الطول الموجي 280nm تحددها الأشعة فوق البنفسجية مرئية الإجار .

بعض الخدمات التجريبية