floo-8 أنا خلية خالية من غسل تدفق الكالسيوم كاشف عدة

floo-8 أنا خلية خالية من غسل تدفق الكالسيوم كاشف عدةالمكونات والمواصفات على النحو التالي . واقترح أن كمية التحميل كاشف الخلية floo-8 96-porous لوحة 100 ميكرولتر في حفرة ، 384-porous لوحة 25 ميكرولتر في حفرة . 96t 960t , و 9600t يمكن الانتهاء من 1 ، 10 ، 100 قطعة 96-hole أو 384-hole لوحات على التوالي .

1 ، وفقا لمتطلبات التجربة ، تلقيح الخلايا في الجزء السفلي من 96-pore أو 384-pore شفاف أسود خلية ثقافة المجلس ، تركيز المصل من خلية ثقافة متوسطة لا تتجاوز 10 ٪ . وفقا لمتطلبات التجربة2حاضنة حاضنة لبعض الوقت .
2 ، تأخذ floo-8 تحميل حل العازلة ، مؤسسة قطر ( 10x ) كاشف ، والتوازن في درجة حرارة الغرفة ، تماما مختلطة .
3 - إزالة floo-8 صباحا ، تذوب في درجة حرارة الغرفة ، الطرد المركزي جمع المحتوى في أسفل الأنبوب ، وضعت على الجليد . إذا كان floo-8 صباحا لا تستخدم مرة واحدة ، يجب أن تكون معبأة في - 20 ℃ لتجنب الضوء ، وتجنب تكرار التجميد والذوبان .
4 - حساب الجرعة المطلوبة من أجل تحميل كاشف floo-8 الخلايا حسب حجم الخلية تحميل كاشف
5 ، floo-8 تحميل خلية الكاشف إعداد : 10 × قطر الكاشف المخفف حسب 10 مرات إضافة إلى floo-8 تحميل العازلة ، على سبيل المثال ، 1 مل 10 × قطر الكاشف إضافة إلى 9 مل floo-8 تحميل العازلة ، مختلطة تماما . إن floo-8 صباحا هو 400x ، floo-8 محملة العازلة ( بما في ذلك 1 × قطر ) أضيفت إلى 1 س ، الذي هو عامل التحميل floo-8 الخلايا .
6 ، بعض الخلايا ، مثل خلايا شو ، تحتاج إلى إضافة propenecid ( CAS : 57-66-9 ) في floo-8 تحميل كاشف لمنع الخلايا من دخول floo-8 خارج الخلية . proposulfonate شو هو المقدمة من قبل العملاء أنفسهم ، مما يشير إلى أن التركيز النهائي من proposulfonate شو 2.5mm إضافة إلى floo-8 الخلية تحميل كاشف .
إعداد سلفونات البروم ثنائي الفينيل شو :الحل هو 500 ملم مع 1 ن هيدروكسيد الصوديوم ، ثم تضعف إلى 250 ملم مع 1 × hbss العازلة ، ثم تضاف إلى floo-8 تحميل خلية كاشف ، مع التركيز النهائي 2.5 مم ( hbss العازلة قدمتها العملاء ، مع 20 ملم hepes العازلة الرقم الهيدروجيني 7.4 + 1 × هانك بهارات الحل ، الرقم الهيدروجيني 7-4 ) .
7 ، الطريقة القياسية للكشف عن : إضافة حجم متوسط الثقافة في خلية ثقافة لوحة ، مثل حجم الخلية تحميل كاشف ، على سبيل المثال ، 96-pore لوحة 100 ميكرولتر في حفرة متوسطة الثقافة 100 ميكرولتر إضافة إلى تحميل خلية كاشف .
（طرق الكشف الاختياري :وسائل الإعلام التي تحتوي على 10 ٪ FBS قد تقلل من القراءة وزيادة الخلفية ، ويمكن إزالة مسام متوسطة ، مختلطة مع floo-8 خلية تحميل كاشف ( إعداد الخطوات 5 و 6 ) و hbss عازلة ، إضافة ما يعادل 2 مرات حجم وسائل الإعلام الأصلي للكشف عن هذا الخليط . أو استخدام تركيز منخفض من سلاح متوسطة الثقافة خلية ثقافة ، وفقا للخطوة 7 الطريقة القياسية .
حضنت في 37 ℃ لمدة 1 ساعة . درجة حرارة الحضانة ( على سبيل المثال ، في درجة حرارة الغرفة أو 37 ℃ ) والوقت ( 0.5hr-2hr أو أكثر ) يجب أن يكون الأمثل وفقا لتجربة محددة .
9 - الكشف عن تدفق الكالسيوم داخل الخلايا : وفقا للاحتياجات التجريبية ومعدات الكشف عن الكشف عن مجموعة من المعلمات ، إضافة اختبار المركبات ، أسفل القراءة للكشف عن كثافة مضان . تطبيق معدات الاختبار ، بما في ذلك flexstation ، flipr ( Molecular الأجهزة ) ، الخ . إن flexstation 3 يقرأ مضان مع السابقين / م = 485 / 525 نانومتر .

1 ، دفعة مختلفة لا ينصح خلط .
2 ، عدم وجود أدلة تجريبية ، لا ينصح بتغيير جرعة الكاشف .