مجموعة اختبار CHIP (المغناطيسية)

رقم الشحنسCH1581/CF1581/CM1581/CG1581

حالة التخزينس4 درجة مئوية

وصف المنتج

رقاقة كاشف عدة تستخدم لإيداع لونين شظايا ملزمة البروتين المستهدف من خلال immunoprecipitation ، وأخيرا الكشف عن رواسب لونين شظايا من الاسترداد أو جنوب الأسلوب . عادة ما تستخدم للكشف عن ما إذا كان الحمض النووي الجينوم محددة ملزمة البروتينات مثل عوامل النسخ أو هيستون في نفس المجمع كما هو متوقع من تسلسل الحمض النووي الجينوم محددة . في الجسم الحي ( في فيفو ) البروتين المستهدف و الحمض النووي الجينوم المتوقع شظايا في نفس المجمع يمكن الحصول عليها عن طريق رقاقة الكشف . نتائج اختبار رقاقة يمكن أن تشير بوضوح إلى أن هذا الربط يحدث في الخلايا .

بن .ها / dykdddk / Myc / هذه الشراكه nanoab-magnetic حبات كانت تستخدم في الكشف عن رقاقة عدة . هذه المجموعة يمكن أن تستخدم لتضخيم جزء من تسلسل المقابلة البشرية gapdh . التمهيدي تسلسل 5 ' - tactagcggtttacggggggg-3 ' ؛ 5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’。

خطوات التشغيل ( للرجوع اليها فقط ) :

أولاً - تحسين ظروف المعالجة بالموجات فوق الصوتية للعينات :

1 - إعداد برنامج تلفزيوني و 100 ملم pmsf precooling . . . . . . . الحزب الديمقراطي الصربي lysis العازلة كان يذوب تماما في حمام دافئ و يخلط جيدا .

2 . الخلايا المستزرعة في 250px خلية ثقافة طبق بتري مع جرعة من 10 مل - كمية مناسبة من الفورمالديهايد أضيفت مباشرة إلى خلية ثقافة وسائل الإعلام في الوقت المتوقع من البروتين الهدف و الحمض النووي الجينوم ملزمة ، مختلطة بلطف حتى التركيز النهائي هو 1 ٪ . ثم حضنت في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق عبر ربط البروتين الهدف وما يقابلها من الحمض النووي الجينوم . على سبيل المثال : 270ul 37 ٪ الفورمالديهايد يجب أن تضاف إلى خلية ثقافة 250px طبق بتري مع 10 مل من خلية ثقافة الحل . يرجى الانتباه إلى استخدام الفورمالديهايد عالية الجودة والفعالية في الحياة قدر الإمكان . ويمكن أيضا أن تكون الخلايا المستزرعة في 150px خلية ثقافة طبق بتري .

3 . إضافة 1.1ml جليكاين الحل ( 10x ) وتخلط جيدا . يوضع في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق .

4 - وضع طبق الثقافة مع عينة من الخلايا في حمام الثلج . امتصاص الفورمالديهايد جليكاين تحتوي على سائل الثقافة ، في محاولة للحفاظ على أي بقايا السائل .

5 - برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ملم pmsf أعدها تمييع 100mm pmsf 1mm مع precooling برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق . المياه القائمة على حل pmsf يجب أن تكون طازجة و نصف الحياة في المرحلة المائية حوالي 30 دقيقة .

6 - إضافة 5-10ml precooled برنامج تلفزيوني ( بما في ذلك 1 ملم pmsf ) ، وغسل الخلايا ، تمتص السائل قدر الإمكان للحفاظ على أي بقايا السائل .

7 - إضافة 5-10ml precooled برنامج تلفزيوني ( بما في ذلك 1 ملم pmsf ) كذلك غسل الخلايا ، تمتص السائل قدر الإمكان للحفاظ على أي بقايا السائل .

8 - إضافة 1 مل من precooled برنامج تلفزيوني ( بما في ذلك 1 ملم pmsf ) ، كشط الخلايا مع خلية مكشطة ، وجمع في أنبوب الطرد المركزي . إذا كانت الخلايا يمكن أن تكون في مهب أسفل مع بندقية ، أو أنها يمكن أن تكون في مهب أسفل مع بندقية . عد الخلايا إلى حوالي مليون خلية في أنبوب .

9 - 4 درجة مئوية ، 800-1000g الطرد المركزي لمدة 1-2 دقيقة ، تماما يعجل الخلايا . إذا لم يتم العثور على ما يكفي من هطول الأمطار ، الطرد المركزي الوقت يمكن أن تكون مناسبة لفترات طويلة . يستنشق طاف ، والحد من بقايا السائل قدر الإمكان .

10 - إعداد كمية مناسبة من الحزب الديمقراطي الصربي lysis عازلة تحتوي على 1 ملم pmsf . . . . . . . 1 مليون خلية هطول في الخطوة السابقة كانت معلقة مع الحزب الديمقراطي الصربي lysis عازلة تحتوي على 1 ملم pmsf 0.2ml . . . . . . .

11 - احتضان الخلايا في حمام الثلج لمدة 10 دقائق .

12 - العلاج بالموجات فوق الصوتية قطع الحمض النووي الجينوم ، وجعل معظم الحمض النووي إلى 200-1000bp الحجم ، إذا كان يمكن السيطرة على معظم أجزاء في 400-800bp سيكون أفضل . أثناء عملية الموجات فوق الصوتية ، يرجى الانتباه إلى الحفاظ على العينة في حمام الثلج للحفاظ على درجة حرارة منخفضة . تأثير القص بالموجات فوق الصوتية يمكن الكشف عنها بواسطة الحمض النووي الاغاروز الكهربائي الهلامي بعد إزالة يشابك . حالة العلاج بالموجات فوق الصوتية يمكن أن تكون عادة مجموعة من 10 ثانية في كل مرة ، ما مجموعه 3-4 مرات ، 50 واط من الطاقة إلى مجموعة من 30 ٪ من الطاقة القصوى ، وذلك باستخدام 2 مم بالموجات فوق الصوتية الرأس .

بالموجات فوق الصوتية معدات معالجة مختلفة الإعداد ، استكشاف ظروف الموجات فوق الصوتية ، يمكنك تحديد الشروط الأخرى ، أولا تحديد كم من الوقت في كل مرة لن يؤدي إلى ارتفاع درجة الحرارة ، ثم استكشاف مختلف الموجات فوق الصوتية مرة . حتى العثور على عدد مناسب من الموجات فوق الصوتية يمكن أن تجعل معظم الجينومالحمض النووي هو كسر في حجم 200-1000bp . وينبغي إيلاء الاهتمام إلى أن حجم الخلية بالموجات فوق الصوتية الجرعة ينبغي أن تكون ثابتة في كل مرة ، وإلا فإنه لا يمكن استخدام الموجات فوق الصوتية ثابتة نسبيا شرط متابعة التجارب .

الحواشي: بعد دراسة الجينوم بالموجات فوق الصوتيةعندما يتم الكشف عن حجم الحمض النووي ، إذا كنا استخدام الاغاروز هلام تلطيخ ( أي إضافة الحمض النووي الصبغ في تحميل العازلة ) أو هلام تلطيخ الأسلوب ، الحزب الديمقراطي الصربي سوف تتحد مع هذا النوع من الصبغ على شكل شريط غير طبيعي ، وعادة ما تكون في حوالي 500-1000 بي بي ، لذلك سوف يكون لها بعض التأثير على حجم الحمض النووي الجينوم بالموجات فوق الصوتية الحكم . ويقترح أن بعد تلطيخ طريقة يمكن استخدامها للكشف عن حجم الفرقة ، والتي لا يمكن أن تحدث بشكل غير طبيعي ، لا تؤثر على الحكم على حجم الحمض النووي الجينوم بعد الموجات فوق الصوتية ، وعلاوة على ذلك ، فإن حجم الفرقة هو أكثر دقة .

13 - 8ul 5m كلوريد الصوديوم أضيفت إلى 0.2ml بالموجات فوق الصوتية ، ثم يخلط جيدا . يسخن 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لإزالة الربط بين البروتين والحمض النووي الجينوم .

14 - إضافة توازن ثلاثي متساوي القياسالبنزينفين，فورتكس مختلطة بعنف ، ثم طرد حوالي 4 درجة مئوية ، 12000g لمدة 5 دقائق . شفط طاف في آخر أنبوب الطرد المركزي .

15 - إضافة الكلوروفورم متساوي القياس ، فورتكس مختلطة بعنف ، ثم 4 ° C ، 12000g حوالي 5 دقائق الطرد المركزي . شفط طاف في آخر أنبوب الطرد المركزي .

الحواشيسالفينول الكلوروفورم استخراج الخطوات 14 و 15 أعلاه يمكن أن تعمل باستخدام الحمض النووي تنقية عدة .

16 - كمية صغيرة من السوائل التي تم الحصول عليها من الفينول الكلوروفورم استخراج الحمض النووي أو تنقية عدة ، 5-10ul يمكن الحصول عليها من الفينول الكلوروفورم استخراج الحمض النووي أو 2-5ul يمكن الحصول عليها من الحمض النووي تنقية عدة ، الاغاروز الكهربائي الهلامي نفذت لمراقبة تأثير العلاج بالموجات فوق الصوتية على الحمض النووي الجينوم القص .

لونين immunoprecipitation :

1 . بعد تحسين ظروف العلاج بالموجات فوق الصوتية من العينة ، عينة لفحصها وفقاتحسين ظروف العلاج بالموجات فوق الصوتيةوسط1-11الخطوات العملية ، مع الإشارة إلى الخطوات12 . إجراء العلاج بالموجات فوق الصوتية

2 . بالموجات فوق الصوتية علاج العينات في 4 درجة مئوية ، 12000-14000g الطرد المركزي لمدة 5 دقائق . إزالة ( حوالي 0.2ml ) إلى 2 مل أنبوب الطرد المركزي ، ووضعها في حمام الثلج .

3 - إعداد كمية مناسبة من رقاقة عازلة تحتوي على 1 ملم pmsf . . . . . . . إضافة 1.8ml رقاقة عازلة تحتوي على 1 ملم pmsf تمييع بالموجات فوق الصوتية تجهيز العينات ، مما يجعل حجم النهائي 2 مل .

4 . 20ul عينة يؤخذ كمدخل بعد الكشف . جلب20ul HA / DYKDDDDK / Myc / GFP-Nanoab-الخرز المغناطيسيةإضافة .برنامج تلفزيوني أو tbst الحل هو غسلها في مهب حتى 500ul ، وضعت على رف المغناطيسي بعناية شطف طاف مع ماصة ، وغسلها مرتين أو ثلاث مرات ( 1-5 ٪ جيش صرب البوسنة أو الحليب الخالي من الدسم يمكن أن تستخدم أيضا من أجل تحسين الحد من عدم التحديد 1 لمدة 1 ساعة ) .

5 . تنظيف أو إغلاق20ul HA / DYKDDDDK / Myc / GFP-Nanoab-الخرز المغناطيسيةإضافة خطوة3 - وفي الوقت نفسه ، يمكن استخدام عينات من الخلايا خالية من الحل كما فارغة السيطرة ، فضلا عن عينات من دون beads سلبية السيطرة ، أو استخدام الأجسام المضادة السلبية مستقلة السيطرة . في 4 ° C بالتناوب ببطء أو يتأرجح بالتساوي لمدة 30-60 دقيقة من أجل إيداع البروتين الهدف أو المقابلة المعقدة .

6 . وضع أنبوب الطرد المركزي مع العينة أعلاه على حامل المغناطيسي لمدة 10 ثوان . إزالة طاف بعناية فائقة ، لا تلمس الرواسب . بعد ذلك يتم غسلها مع الحل التالي بدوره ، كل جرعة من محلول الغسيل هو 1 مل ، كل مرة في 4 درجة مئوية ببطء أو يتأرجح غسل 3-5 دقائق ، ثم يوضع على رف المغناطيسي 10 ثانية بعناية إزالة طاف السائل ، لا تلمس الترسيب .

( أ ) غسلت مرة واحدة سالت إمون كومبلكس فاش بافر .

( ب ) غسلت مرة واحدة سالت إمون كومبلكس واش بافر .

( ج ) تغسل ليكل إمون كومبلكس واش بافر مرة واحدة .

( د ) تغسل شركة Te Buffer مرتين .

الحواشيسالأمطار التي تم الحصول عليها بعد الانتهاء من جميع خطوات الغسيل يمكن استخدامها لتضخيم PCR تسلسل الجينات المستهدفة ، أو الكشف عن تسلسل الجينات المستهدفة مع الجنوب ، أو الكشف عن الغربية ، وما شابه ذلك .

ثالثاتضخيم PCR تسلسل الجينات المستهدفة ( على سبيل المثال ، رقاقة المنتجات المستخدمة للكشف عن تسلسل الجينات المستهدفة ) :

1 - كمية مناسبة من التوتر عازلة ( 1 ٪ الحزب الديمقراطي الصربي ، 0.1m NaHCO3 ) أعدت حديثا .

2 - استكمال الخطواتimmunoprecipitation خطوة第7بعد الانتهاء من جميع خطوات الغسيل ، إضافة250ul Elution buffer。 فورتكس يمزج جيدا ، بالتناوب في درجة حرارة الغرفة أو يتأرجح على الاستمرار في عملية الاستخراج لمدة 3-5 دقائق .

3 - وضع على رف المغناطيسي لمدة 10 ثوان ، ونقل طاف في أنبوب الطرد المركزي الجديد . . . . . . . إضافة 250ul عازلة في هطول الأمطار . فورتكس يمزج جيدا ، بالتناوب في درجة حرارة الغرفة أو يتأرجح على الاستمرار في عملية الاستخراج لمدة 3-5 دقائق .

4 - وضع على الإطار المغناطيسي لمدة 10 ثوان ، وإزالة طاف . . . . . . . و في الخطوة السابقة ، وهذا هو ، في الخطوة 3 . مجموع حوالي 500ul طاف .

5 - إضافة 20ul 5M كلوريد الصوديوم في 500ul supernatants وخلط جيدا . يسخن 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لإزالة الربط بين البروتين والحمض النووي الجينوم . 20ul العينات التي تم الحصول عليها في الخطوة 2D ، إضافة 1ul 5M كلوريد الصوديوم ، مختلطة بالتساوي ، يسخن في 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ، كما تستخدم لإزالة الربط بين البروتين و الحمض النووي الجينوم . بعد الانتهاء من هذه الخطوة ، يمكنك الاستمرار في الخطوة التالية ، أو يمكنك تجميد - 20 درجة مئوية ، في اليوم التالي إلى مواصلة الخطوة التالية .

الحواشي1: في هذا الوقت عينة متاحة بالفعلPCR， 1 ، 2 ، 5 أو 10 ul عينات يمكن استخدامها كنموذج PCR للكشف عن الجينات المستهدفة . في هذه الحالة ، فإن تأثير الاسترداد هو ذات الصلة إلى كمية الحمض النووي التي قد يعجل ، وما إذا كان كامل نظام الاسترداد يمكن بسهولة تضخيم الجينات المستهدفة . إذا كان تأثير الاسترداد هو العثور على أن تكون غير مرضية ، ثم تنقية وتركيز العينات يمكن النظر فيها .

الحواشي2عادة ، بعد تنقية الموصى بها .في العام ، لا مزيد من تنقية خطوة ضرورية .

6 - إضافة 10ul 0.5m EDTA ، 20ul 1m تريس الرقم الهيدروجيني 6.5 و 1ul 20mg / ml البروتيني ك في حوالي 520ul العينات ، ثم احتضان 45 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة .

7 . إضافة توازن حجم ثابت تريسالبنزينفين，فورتكس مختلطة بعنف ، ثم طرد حوالي 4 درجة مئوية ، 12000g لمدة 5 دقائق . شفط طاف في آخر أنبوب الطرد المركزي .

8 - إضافة isovolume الكلوروفورم ، فورتكس مختلطة بعنف ، ثم 4 درجة مئوية ، 12000g الطرد المركزي لمدة 5 دقائق . شفط طاف في آخر أنبوب الطرد المركزي .

9 - إضافة 20 ميكروغرام أو glycogen Yeast الحمض الريبي النووي النقال ، إضافة 1 / 10 حجم 3M ناك ، الرقم الهيدروجيني 5-2 ، ثم إضافة 2.5 مرة حجم الإيثانول المطلق . بعد خلط - 70 درجة مئوية هطول الأمطار لا تقل عن 1 ساعة ، أو - 20 درجة مئوية هطول الأمطار أكثر من 8 ساعات .

10 - 4 درجة مئوية ، 12000-14000g الطرد المركزي لمدة 10 دقائق ، بعناية إزالة معظم طاف ، لا تلمس الرواسب .

11 - إضافة حوالي 1 مل من 70 ٪ من الإيثانول غسل هطول الأمطار . 4 ° ج ، 12000-14000g الطرد المركزي لمدة 10 دقائق ، بعناية إزالة معظم طاف ، لا تلمس الرواسب .

12 - 4 درجة مئوية ، 12000-14000g الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة ، بعناية إزالة بقايا السائل .

13 - كمية صغيرة من الحمض النووي أو إعادة تعليق تي المياه المستخدمة في الكشف عن الجينات المستهدفة PCR . اثنين من مجموعات من الاشعال المستخدمة في الاسترداد يمكن أن تكون مصممة على نحو أفضل ، يمكن استخدام المدخلات كقالب للحصول على المقابلة بكر الظروف مسبقا ، واختيار مجموعة من الاشعال مع تأثير جيد في نهاية المطاف بكر الكشف . في بعض الحالات ، عندما تكون ضعيفة جدا ، متداخلة PCR يمكن استخدامها في اثنين من جولات من التضخيم .

الحواشيخطوات7 - الخطوات 13 يمكن أيضا تنقية الحمض النووي مع مناسبة تنقية الحمض النووي عدة .

رابعاالكشف عن المنتجات الغربية رقاقة ( إذا كان رقاقة المنتجات المستخدمة في الكشف عن الغربية ) :

1 . الخطوة التاليةلونين immunoprecipitation第بعد الانتهاء من جميع خطوات الغسيل ، 25ul صفحة الحزب الديمقراطي الصربي عينة عازلة ( 1x ) أضيفت . صفحة الحزب الديمقراطي الصربي البروتين عينة عازلة ( 1x ) يمكن أن تكون على استعداد مع صفحة الحزب الديمقراطي الصربي البروتين عينة عازلة ( 5x ) المخفف بالماء . حمام الماء المغلي يغلي لمدة 10 دقائق .

2 - أخذ 10-20ul للكشف عن الغربية .

ملاحظة :

1 ، تحتاج إلى إعداد النفس رقاقة مقاومة ، 37 ٪ الفورمالديهايد ، PBS，PMSF，Elutioin (1% SDS, 0.1M NaHCO3)， البروتيني ك ، glycogen أو الحمض الريبي النووي النقال ، تريس التوازنالبنزينفينالكلوروفورم95 ٪ إيثانول ، 70 ٪ إيثانول ، 3M ناك ( الرقم الهيدروجيني 5-2 ) المغناطيسي حامل ، خلية مكشطة أو خلية مجرفة .

2 ، تحتاج إلى إعداد عينة بالموجات فوق الصوتية المعالج ( sonicator ) ، المعروف أيضا باسم بالموجات فوق الصوتية بالموجات فوق الصوتية أو الخلية محطم محطم .

3 ، عند استخدام الفورمالديهايد ، يرجى إجراء العملية في مجلس الوزراء .

4 ، المنتج يقتصر على البحث العلمي من المهنيين ، لا تستخدم في التشخيص السريري أو العلاج ، لا تستخدم في الغذاء أو المخدرات ، لا يمكن تخزينها في المنازل العادية .

6 ، من أجل السلامة والصحة ، يرجى ارتداء ملابس المختبر وارتداء القفازات القابل للتصرف العملية .