خلاصة

فيروس الحمى القلاعية ( FMDV ) vp2 البروتين هو واحد من أهم المستضدات الهيكلية ، وتحليل مستضدات بدائيات التعبير المنتج مهم جدا لتطوير لقاح جديد . في هذه الدراسة ، ونحن بناء نظام التعبير عالية الكفاءة مع ميني نبض 399 الاقتصادية الصعق الكهربائي ، وتحسين ظروف التحول من كولاي bl21 ( de3 ) لتحقيق التعبير عن vp2 للذوبان البروتين . اليسا و لطخة غربية أظهرت أن نشاط ملزمة محددة من المنتجات مع الأجسام المضادة ضد فيروس الحمى القلاعية كان 89 ٪ من البروتين الطبيعي ، وتوفير الدعم التقني من أجل إنتاج اللقاحات منخفضة التكلفة .

مقدمة

مرض الحمى القلاعية ( الحمى القلاعية ) هو مرض معد خطير يهدد الثروة الحيوانية - البروتين الهيكلي vp2 من فيروس الحمى القلاعية ( FMDV ) تشارك في الجمعية قفيصة الفيروسية و هو مفتاح حاتمة ناقلات حمل المضيف لإنتاج تحييد الأجسام المضادة . بدائيات التعبير النظام أصبح منصة لإنتاج VP2 مستضد البروتين على نطاق واسع بسبب عملية بسيطة ومنخفضة التكلفة . ومع ذلك ، vp2 البروتين يحتوي على وفرة β - مطوية هيكل ، والتي من السهل أن تشكل إدراج الجسم في كولاي . وعلاوة على ذلك ، فإن أساليب التحول التقليدية لديها بعض المشاكل ، مثل انخفاض الكفاءة ، تلف الخلايا ، وهلم جرا .

الصعق الكهربائي هو وسيلة أساسية من أجل نقل الجينات في الخلايا بدائية النواة الخارجية عن طريق تغيير عابر نفاذية غشاء الخلية من خلال نبض الحقل الكهربائي . من خلال كسر من خلال الحد من المعدات التقليدية ، وينيد ميني نبض 399 اقتصادا الصعق الكهربائي جهاز يستخدم عالية الدقة نبض أسي التكنولوجيا في الوقت الحقيقي نظام مراقبة قوس ، والتي يمكن أن تضمن ارتفاع معدل البقاء على قيد الحياة من الخلايا وتحسين كفاءة التحويل بشكل ملحوظ . الحد الأدنى من واجهة التشغيل يمكن تشغيلها بواسطة مفتاح واحد فقط من خلال تحديد الجهد المعلمة ، ويمكن أن تكون مطابقة بمرونة مع مختلف أنواع العينات مثل بدائيات النوى ، الخلايا حقيقية النواة والكائنات الحية الدقيقة ، وما إلى ذلك ، مع مساعدة من تصميم مستقل electrotransposition ، وبالتالي توفير حل مبتكر من أجل التعبير عالية الكفاءة والحفاظ على مستضدي VP2 البروتين من مرض الحمى القلاعية .

المواد والأساليب

1 - المواد التجريبية

الهدف : جين V2 تسلسل الترميز ( VP22 الترميز تسلسل فيروس الحمى القلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلالقلفيروس س س س س س س س س س س س س س س س س سلالة الفيروس س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س سلالة الفيروس س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س س تنقية عدة ( العلامة التجارية ، بما في ذلك ني NTA كروماتوجرافيا الألفة الراتنج ) ، فيروس الحمى القلاعية محددة الأجسام المضادة بولكلونل

2 - الصكوك الرئيسية

وينيد ميني نبض 399 اقتصادا electroporation الصك ( مجهزة 0.1cm electroporation كأس ، مع مناسبة prokaryocyte التحول ، مستقلة electrotransposition الدعم السريع استبدال النظام التجريبي ) عالية السرعة الطرد المركزي المبردة ( العلامة التجارية ، سرعة دوران دقة ± 50 دورة في الدقيقة ، درجة الحرارة مجموعة من 4-40 ℃ ) درجة حرارة ثابتة يهزّ طاولة ( العلامة التجارية ، سرعة دوران مجموعة من 20-300 دورة في الدقيقة ، والتحكم في درجة الحرارة دقة ± 0.1 ℃ ) مضان الكمية PCR الصك ( العلامة التجارية ، من أجل إعادة التركيب البلازميد عدد النسخ الكاشف ) العلامة التجارية هلام الكهربائي ( sds-800nm التدرج في الطول الموجي ، العلامة التجارية ، ودعم نظام التحليل )

بناء نظام بدائيات التعبير

بناء البلازميد المؤتلف

إن vp2 تسلسل الحمض النووي تم تحويلها إلى القولونية dh5 α الخلايا المستشعرة عن طريق ربط pet-32a ( + ) ناقلات مع نفس المعاملة من قبل ndei و xhoi . . . . . . . مستعمرة واحدة كانت معزولة من رطل متوسطة تحتوي على أمبيسلين ، ثم تم استخراج البلازميد المؤتلف pet-32a-vp2 من الاغاروز الكهربائي الهلامي و التسلسل .

2 - إعداد الخلايا المستقبلة

50 μ ل كولاي bl21 ( de3 ) تم تلقيح في 5 مل رطل متوسطة من - 80 ℃ بالتبريد و مثقف في 37 ℃ OD ₀ = 0.6 . بعد حمام الثلج لمدة 30 دقيقة ، تم جمعها في 4 ℃ و 5000rpm الطرد المركزي لمدة 10 دقائق ، ثم تم غسلها ثلاث مرات مع precooled electrotransfer العازلة ، وأخيرا علقت في 10 ٪ من الجلسرين الحل ، ثم تم تعديل تركيز الخلية إلى 5 × 10 ⁹ كفو / مل ، ثم معبأة في 50 ميكرولتر / أنبوب .

3 - تحسين تحويل الصعق الكهربائي

5 ميكرولتر البلازميد المؤتلف ( تركيز 1 ميكروغرام / ميكرولتر ) كانت مختلطة مع 50 ميكرولتر من الخلايا المستشعرة و نقلها إلى 0.1 سم electrocooling كأس . في وينيد ميني نبض 399 الصعق الكهربائي الصك ، حدد وضع الخلية بدائية ، تعيين المعلمة الجهد 1.8kv ( حسب القيمة المثلى من قبل التجربة ) ، انقر على زر ابدأ على شاشة تعمل باللمس ، الصك تلقائيا يولد عالية الدقة موجة النبض الأسي . بعد الانتهاء من نبض ، 950 μ ل رطل متوسطة الثقافة دون مقاومة أضيفت على الفور ، و 100 μ ل رطل لوحة المغلفة مع أمبيسيلين في 37 ℃ لمدة 1 ساعة بعد الانتعاش متذبذبة .

4 - الحث على التعبير وتنقية البروتين

استنساخ إيجابية تم تلقيح في رطل متوسطة تحتوي على أمبيسيلين في 5 مل - التطوير التنظيمي ₀ ₀ = 0.8 في 37 ℃ متذبذبة و تحويلها إلى 500 مل متوسطة الثقافة في نسبة 1 : 100 . عندما التطوير التنظيمي ₀ تصل إلى 1-2 ، IPTG أضيفت للحث على 4 ساعات ، 4 ℃ 8000 دورة في الدقيقة الطرد المركزي لجمع البكتيريا . تم تقسيم الخلايا بواسطة الموجات فوق الصوتية سحق ( 300 واط ، 3S / 5S ، 30 مرة ) و طاف ( بروتين قابل للذوبان ) تم جمعها بعد الطرد المركزي هطول ( إدراج ) . طاف تم تنقيته من قبل ني NTA كروماتوجرافيا الألفة ، ثم 20-500mm إيميدازول استخدمت عملية الاستخراج الانحدار ، البروتين الهدف تم جمعها .

طريقة تحليل مستضدي

1 - الكشف عن لطخة غربية

تنقية البروتين vp2 تم فصلها من صفحة الحزب الديمقراطي الصربي ، ثم نقلها إلى غشاء PVDF ، 5 ٪ مسحوق الحليب الخالي من الدسم كانت مغلقة لمدة 2 ساعة ، و الأجسام المضادة بولكلونل ضد فيروس الحمى القلاعية ( 1 : 5000 تمييع ) أضيفت إلى الحضانة لمدة 1 ساعة ، TBST غشاء غسلها ثلاث مرات ، ثم الأغنام مفتش الأجسام المضادة ( 1 : 10000 تمييع ) أضيفت إلى برنامج الصحة الإنجابية المسمى الأغنام مفتش الأجسام المضادة .

إليسا التحليل الكمي

تنقية البروتين المغلفة مع 96 لوحة المسام في 1 ميكروغرام / مل لمدة 2 ساعة في 4 ℃ لمدة ليلة واحدة ، ثم تم حظره من قبل 1 ٪ جيش صرب البوسنة - مصل فيروس الحمى القلاعية إيجابية مع التدرج تمييع ( 1 : 100 ) ، احتضنت في 37 ℃ لمدة 1 ساعة ، ثم تم غسلها مع HRP المسمى لحم الخنزير مفتش الضد ( 1 : 5000 تمييع ) ، احتضنت في 37 ℃ لمدة 30 دقيقة ، ثم تم الكشف عن TMB مع 2M ₂ حتى ₄ 450 نانومتر . نشاط المستضد النسبي ( التطوير التنظيمي في المجموعة التجريبية / إيجابية في السيطرة على المجموعة × 100 ٪ ) تم حسابها باستخدام البروتين الطبيعي VP2 إيجابية السيطرة .

3 . مقارنة التصميم التجريبي

اثنين من مجموعات المراقبة : المجموعة ( أ ) استخدام طريقة التحويل الكيميائي التقليدي ( cacl ₂ الأسلوب ) ، المجموعة ( ب ) باستخدام العلامة التجارية المشتركة الصعق الكهربائي ( ثابت المعلمة : الجهد 2.0kv / سم ، نبض واحد ) ، وغيرها من الظروف الثقافية مع المجموعة التجريبية . الهدف لمقارنة آثار مختلف أساليب التحول على تحويل البلازميد المؤتلف ، للذوبان في التعبير عن vp2 مستضدي البروتين .

رابعاً - النتائج والمناقشات

1 - تحليل كفاءة التحويل الصعق الكهربائي

معدل التحويل في المجموعة التجريبية تعامل مع وينيد ميني نبض 399 6.5 × 10 ⁸ كفو / ميكروغرام ، أعلى بكثير من تلك التي في المجموعة أ و ب 3.2 × 10 ⁸ كفو / ميكروغرام . وأظهرت النتائج أن عدد النسخ من البلازميد في المجموعة التجريبية بنسبة 25 في المائة مقارنة مع المجموعة باء ، مما يدل على أن دقة عالية الأس موجة النبض يمكن أن تحسن بشكل فعال كفاءة نقل الحمض النووي عبر الغشاء الخارجية . . . . . . . في الوقت الحقيقي نظام الرصد يمكن أن تقلل من احتمال حدوث شرارة كهربائية أقل من 0.5 في المائة ، وتجنب الضرر الذي لا رجعة فيه من نبض الطاقة تقلب على غشاء الخلية ، وبالتالي الحفاظ على ارتفاع معدل البقاء على قيد الحياة من الخلايا المستقبلة ( التريبان الأزرق تلطيخ أظهرت أن معدل البقاء على قيد الحياة من الخلايا أكثر من 90 في المائة ) .

2 - تحليل البروتين للذوبان في التعبير

صفحة الحزب الديمقراطي الصربي الكهربي أظهرت النتائج أن هناك فرق واضح من البروتين الهدف في المجموعة التجريبية بعد 4 ساعات من الحث ، الوزن الجزيئي حوالي 42 كدا ، وهو ما يتسق مع نظرية القيمة . تحليل البرمجيات أظهرت أن imagej البروتين للذوبان في المجموعة التجريبية تمثل 58 في المائة من مجموع التعبير ، أعلى بكثير من 22 في المائة في المجموعة و 41 في المائة في المجموعة باء . وأظهرت النتائج أن 18.7mg للذوبان البروتين vp2 يمكن الحصول عليها في لتر من الثقافة في المجموعة التجريبية ، 52 ٪ أعلى من 12.3mg في المجموعة باء ، ما يقرب من 9 مرات أعلى من 2.1mg في المجموعة أ . هذا هو بسبب تصميم خلية صديقة ميني نبض 399 . نبض المعلمات تلقائيا مباراة بدائيات غشاء الخلية من خلال المدمج في خوارزمية ، مما يقلل من الخطأ طي البروتين الناجم عن الإجهاد الخلوي ، وتحسين كفاءة التعبير للذوبان من المصدر .

3 - تقييم نشاط مستضدي

وجافاسكريبت الغربية أظهرت النتائج أن تنقية البروتين كان رد فعل معين مع الأجسام المضادة لفيروس الحمى القلاعية في المجموعة التجريبية ، مع كثافة مماثلة لتلك التي من البروتين الطبيعي . اليسا التحليل الكمي أظهرت أن نسبة نشاط المستضد هيستون كان 89 ٪ ، أعلى بكثير من 65 ٪ في المجموعة ب و 32 ٪ في المجموعة أ . تحليل ديتشرويسم دائرية ( ديتشرويسم دائرية ) أظهرت أن β - أضعاف محتوى البروتين في المجموعة التجريبية كان 35 ٪ ، على مقربة من 38 ٪ من البروتين الطبيعي ، مما يدل على أن السلامة الهيكلية الثانوية كان أفضل من السيطرة على المجموعة .

التعاون بين المعدات والتكنولوجيا التجريبية المعلمات

وينيد ميني نبض 399 يظهر ثلاث مزايا أساسية في هذه الدراسة :

الحد الأدنى من الكفاءة التشغيلية : لا تحتاج إلى تصحيح المعلمات معقدة ، فقط مجموعة من الجهد يمكن أن تبدأ ، عملية جديدة تستغرق 40 ٪ أقل من التقليدية الصعق الكهربائي ، وتحسين كفاءة التجربة ، وخاصة بالنسبة دفعة متعددة عملة الفرز .

دقة نبض الحماية : عالية الدقة نبض موجة أسية جنبا إلى جنب مع الوقت الحقيقي رصد قوس ، مع ضمان كفاءة التحويل ، في حين أن معدل وفيات الخلايا تحت 10 ٪ ، من أجل التعبير عن بروتين قابل للذوبان لتوفير بيئة مستقرة المضيف .

مناسبة لأنّ مشاهد متعددة : تصميم مستقل يدعم التبديل السريع بين 0.1cm و 0.2cm الكهربائية الدوارة الكؤوس مع مواصفات مختلفة ، والتي لا يمكن إلا أن عملية عينة صغيرة من ميكروغرام ، ولكن أيضا يمكن أن تكون متوافقة مع متطلبات تحويل تدفق عالية ، والتي يمكن أن تلبي كامل عملية التطبيق من البحوث الأساسية إلى عملية التحسين في المختبر .

وقد وجد أن تركيز الخلية والجهد المعلمات يجب أن تكون منسقة بدقة : عندما يكون تركيز الخلية أعلى من 8 × 10 ⁹ كفو / مل ، الجهد يجب تعديلها إلى 1.6kv لتجنب الإفراط في المجال الكهربائي المحلي . عند تركيز الجلسرين يتقلب ± 2 ٪ في electrorotation العازلة ، ذكي وظيفة التعويض من الصك يمكن تلقائيا معايرة نبض الطاقة لضمان استقرار كفاءة التحويل ( RSD ≤ 3 في المائة بين دفعات ) . هذه التفاصيل تعكس القدرة على التحكم بدقة المعدات تحت ظروف تجريبية معقدة ، وتوفير ضمان موثوق للتكرار التقني .

سادساً - آفاق التطبيق

1 - الإنتاج الصناعي للقاحات البيطرية

الهدف من إنشاء نظام بدائيات التعبير vp2 البروتين ، والتي يمكن استخدامها مباشرة في إنتاج لقاح الحمى القلاعية . تكلفة تحويل دفعة واحدة يمكن أن تنخفض بنسبة 30 ٪ أو أكثر من خلال الموقع الاقتصادي وكفاءة عالية الأداء من وينيد ميني نبض 399 . المعلمة التتبع و استقرار المعدات التي تلبي معايير برنامج الرصد العالمي يمكن أن توفر الدعم الرئيسي لنظام مراقبة الجودة في إنتاج اللقاحات الشركات .

2 - الفرز الفائق الإنتاجية المستضدات متعددة مسببات الأمراض

وحدات تصميم ميني بولسر 399 يمكن بسرعة تبديل السلالات المضيفة ( على سبيل المثال ، كولاي ، السالمونيلا ) ، جنبا إلى جنب مع 96 حفرة لوحة electrotransfer التبعي ( اختياري ) لتحقيق التعبير الموازي و مستضدي الفحص الأولي ، وتقصير فترة اختبار عينة واحدة من 72 ساعة إلى 48 ساعة ، ومن الواضح أن تسريع تطوير لقاح جديد .

3 - البيولوجيا التركيبية وتطوير الكواشف التشخيصية

في مجال تحرير الجينات أداة التسليم ( على سبيل المثال ، crispr-cas9 إدخال نظام الهندسة البكتيريا ) و إعداد المواد الخام من أدوات التشخيص ، وانخفاض الضرر تحويل خصائص الجهاز يمكن تحسين التعبير عن البروتينات المعقدة القابلة للذوبان ، وخاصة بالنسبة للمستضد البروتينات الغنية في ثاني كبريتيد السندات أو ارتباط بالغليكوزيل المواقع . على سبيل المثال ، في فيروس الحمى القلاعية التنميط الجيني وكلاء التشخيص ، وارتفاع نشاط vp2 التعبير البروتين يمكن أن تزيد من حساسية الكشف عن إليسا بنسبة 15 في المائة ، وتوفير أكثر دقة الكشف عن أداة أساسية في المختبرات البيطرية .

وينيد ميني نبض 399 اقتصادا الصعق الكهربائي هو أداة مثالية لتحسين نظام بدائيات التعبير بسبب كفاءة عالية القدرة على تحويل الخلايا الصديقة والمرونة . الجهاز يوفر 7 * 24 ساعة من الدعم التقني و سلالة مجانا المعلمة الأمثل الخدمة ، وقد تم التحقق من صحة من قبل عشرات من الأدوية البيطرية الشركات المحلية والجامعات والمختبرات ، تساعد الباحثين على كسر عنق الزجاجة من المؤتلف البروتين التعبير ، وتعزيز تطوير التكنولوجيا من اللقاحات البيطرية والكواشف التشخيصية الصناعة .

المراجع

1 - التقدم المحرز في دراسات عن مرض الحمى القلاعية في الماشية [ ي ] ؛ تشن وى . هان ون يو . الصينية مجلة الطب البيطري الوقائي ، 2001 ، رقم 4

2 - تحليل النشاطات المحايدة على فيروس مرض الفم والسفاف. [ي]. إي فاف؛ إتش جي ثيل؛ إي بيك؛ ك ستروهماير؛ H شالر، مجلة علم الفيروسات. 1988، 第6期

3 - الكشف عن ناقلات فيروس مرض الفم والسفاف بين الماشية المقطعة. [ي]. ب؛ مونين؛ ل؛ جاكوبز؛ ألف؛ كرينين؛ أ ؛ ديكر ، علم الأحياء الدقيقة البيطري. 2004 ، 第3-4期

4 - تطوير واستخدام بروتين 3ABC مجدد التركيب المحتوي على النيل الحيوي في اختبار ELISA التنافسي في المرحلة الصلبة للكشف عن الأجسام المضادة لفيروس مرض الفم والسفاف. [ي]. كيتشينغ P؛ تشو إم؛ غاليك ب؛ كلافيو أ؛ ثقب ك ، مجلة طرق الفيروسات. 2004 ، 第2期

5- تطوير الـ NSP ELISA ومقارنته بأساليب التشخيص التفاضلية [ي]. كوين تش؛ كو ي جي؛ لا، جي جي. تشوي كيه إس؛ سون HJ؛ لي SY؛ لي كيه إن؛ كيم واي، اللقاح.2003، 第13期

6- التمييز بين الحيوانات التي تتعافى من مرض الفم والسفاف عن طريق الببتيد ELISA[ي]. شرطة تشن ي جي؛ شين ف؛ بيت J؛ والفيلد AM؛ وانغ سي آي؛ براون F، Vaccine.1999، 第23期