خلاصة

البروتيوجليكان الأساسية تلعب دورا هاما في إصلاح الأنسجة المرضية ، ولكن بدائيات التعبير يواجه العديد من المشاكل ، مثل انخفاض كفاءة التحويل وضعف نشاط البروتين . في هذه الدراسة ، ونحن بناء كفاءة عالية بدائيات التعبير مع نظام ثنائي الموجة الصعق الكهربائي الهدف : تحسين ظروف التحول من كولاي bl21 ( de3 ) من قبل اثنين من موجة التكنولوجيا التعاونية ، وتحسين معدل التحويل من البلازميد المؤتلف بنسبة 40 ٪ ، وتوفير الدعم التقني لإنتاج عالية النشاط البروتيوجليكان الأساسية على نطاق واسع .

مقدمة

باعتبارها عنصرا هاما من عناصر المصفوفة خارج الخلية ، decorin يلعب دورا رئيسيا في السيطرة على تشكيل ألياف الكولاجين ، وتمنع انتشار الخلايا السرطانية وغيرها من العمليات الفسيولوجية . ومع ذلك ، هناك العديد من المشاكل في نظام بدائيات التعبير ، مثل غشاء الخلية تأثير الحاجز ، وانخفاض كفاءة نقل البلازميد المؤتلف البروتين إدراج تشكيل أثناء الحث على التعبير .

الصعق الكهربائي هو وسيلة أساسية من وسائل إيصال الجينات في الخلايا بدائية النواة ، التي يمكن أن تغير من نفاذية غشاء الخلية من خلال نبض الحقل الكهربائي . وينيد جين pulser X2 موجة مزدوجة الصعق الكهربائي جهاز يكسر من خلال الحد من تعداء التقليدية التكنولوجيا ، يدمج اثنين من موجة التعاون والتكنولوجيا الذكية نظام الحماية ، والتي يمكن أن تتطابق مع موجة مربعة و أسي موجة بدقة وفقا لخصائص غشاء هيكل الخلية بدائية ، وبالتالي تحسين كفاءة التحويل مع ضمان ارتفاع معدل البقاء على قيد الحياة من الخلايا . المدمج في قاعدة بيانات تضم 200 + أنواع من خطوط الخلايا القولونية ، السالمونيلا ، وما إلى ذلك تستخدم عادة بدائيات التعبير المضيفين ، جنبا إلى جنب مع ذكي قبل النظام الأمثل ، يمكن بسرعة تحديد معالم سلالة جديدة ، وتوفير حل ثوري لبناء كفاءة عالية ومستقرة بدائيات التعبير الأساسية proteoglycan النظام .

المواد والأساليب

1 - المواد التجريبية

كولاكولاكولاكولاكولاي bl21 ( de3 ) ( الحفاظ في المختبر ، من خلال تسلسل التحقق من أن الخلفية الوراثية واضحة ) الجينات المستهدفة : الإنسان الأساسية البروتينوغليكان تسلسل الترميز ( RT-PCR من الخلايا الليفية الطبيعية من خلال RT-PCR استنساخ ، من خلال سلسلة من شركة معينة من خلال تسلسل تأكيد تسلسل صحيح من قبل بعض كاشف شركة تسلسل التعبير ناقلات : pet - 28 ألف ( + ) البلازميالبلازميالبلازميالبلازمي ( تحتوي على الجينات المقاومة الكاناميسين ، مختبر التخزين ) كاشف : رطمتوسطة متوسطة الثقافة ( حسب الصيغة القياسية ، حسب الصيغة القياسية ، الكاناميسين ( كاشف ، التركيز النهائي ، التركيز النهائي ، التركيز النهائي ، تركيز 50 ميكروميكروغرام / مل ، 10 مل ، 10 مل / مل ، 10 مل ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، 10 ، العلامة التجارية ، بما في ذلك تقسيم العازلة ، كروماتوجرافيا الألفة الراتنج ، الخ . )

2 - الصكوك الرئيسية

وينيد جين pulser X2 مزدوجة الموجة الصعق الكهربائي ( مجهزة 0.2cm electrocircuit كأس ، سطح القطب هو تعامل مع نانو طلاء موصل ، ومناسبة لتحويل الخلايا الاصلية النووية ) عالية السرعة الطرد المركزي المجمدة ( العلامة التجارية ، مجموعة سرعة دوران 100-15000 دورة في الدقيقة ، والتحكم في درجة الحرارة دقة ± 0.5 ℃ ) درجة حرارة ثابتة يهزّ طاولة ( العلامة التجارية ، وسرعة دوران دقة ± 1 دورة في الدقيقة ، والتحكم في درجة الحرارة مجموعة من 20-60 ℃ ) مضان الكمية PCR ( العلامة التجارية ، المستخدمة في إعادة التركيب البلازميد عدد النسخ من الضوء المرئي دعم نظام الكشف عن ( 20-10 ٪ من العلامات التجارية ، صفحة الحزب الديمقراطي الصربي تركيز البروتين )

3 - بناء نظام بدائيات التعبير

إعداد البلازميد المؤتلف

البروتين الأساسية غليكان تسلسل الترميز تم تحويلها إلى القولونية DH5 α الخلايا المستشعرة عن طريق ربط pet-28a ( + ) ناقلات مع نفس المعاملة من قبل اثنين من enzymic الهضم . البلازميد المؤتلف pet-28a-decorin تم الحصول عليها من خلال الاغاروز الكهربائي الهلامي و التسلسل .

3-2 إعداد الخلايا المستقبلة

كولاي bl21 ( de3 ) تم تلقيح في 5 مل رطل متوسطة في 80 ℃ و مثقف في 37 ℃ تتأرجح حتى od600 = 0.6 . البكتيريا التي تم جمعها في حمام الثلج لمدة 30 دقيقة ، الطرد المركزي في 4 ℃ و 5000rpm لمدة 10 دقائق ، ثم غسلها ثلاث مرات مع precooled electrotransfer العازلة ، وأخيرا إعادة تعليق في 10 ٪ الجلسرين الحل ، ثم ضبط تركيز الخلية إلى 1 × 10 ⁰ كفو / مل ، ثم معبأة في 50 ميكرولتر / أنبوب ، والتي يمكن استخدامها على الفور في electrotransformation أو النيتروجين السائل بعد التجميد السريع - 80 ℃ . . . . . . .

التحسين من الصعق الكهربائي عملة

5 ميكرولتر البلازميد المؤتلف ( تركيز 1 ميكروغرام / ميكرولتر ) كانت مختلطة مع 50 ميكرولتر الخلايا المستشعرة و نقلها إلى precooled 0.2cm electrotransfer كأس . حدد ' prokaryotic الأمثل ' واسطة على وينيد جين نبض X2 الصعق الكهربائي ، وبدء ذكي قبل النظام الأمثل :

1 . موجة مزدوجة تنسيق إعداد المعلمة :وفقا لخصائص غشاء القولون ، مربع موجة النبض ( الجهد هو تعديلها بشكل حيوي حسب تركيز الخلية ، الأولي مسبقا قيمة تناسب تركيبة 1 × 10 ⁰ كفو / مل ) مع موجة النبض الأسي ، نبض عدد 3 مرات ، نبض الفاصلة 1 ثانية .

2 . قوس حماية النظام :قبل المعالجة ، المقاومة قبل الفحص تتم تلقائيا ، نبض الانتاج هو معايرة في الوقت الحقيقي على أساس الموصلية الكهربائية العازلة الكهربائية التناوب لضمان تذبذب الطاقة مجموعة أقل من 1 ٪ .

3 - العمليات التفاعلية الذكية :في الوقت الحقيقي رصد نبض الموجي من خلال 10 بوصة شاشة تعمل باللمس ، دواسة الزناد نبض بعد التأكد من المعلمات صحيحة ، وبالتالي تجنب الأخطاء في التشغيل اليدوي .

بعد التحول ، 950 μ ل رطل متوسطة الثقافة أضيفت على الفور ، ثم 100 μ ل المغلفة على رطل لوحة تحتوي على الكاناميسين . بعد 12 ساعة من الثقافة في 37 ℃ مستعمرة العد ، معدل التحويل ( عدد transformants / ميكروغرام بلازميد الحمض النووي ) حسبت .

تحريض التعبير وتنقية البروتين

استنساخ إيجابية تم تلقيح في 5 مل رطل متوسطة تحتوي على الكاناميسين ، ثم تحولت إلى 500 مل متوسطة الثقافة في 37 ℃ oscillatory od600 = 0.8 . عندما od600 تصل إلى 1.0 ، IPTG أضيفت للحث على 4 ساعات ، 4 ℃ 8000 دورة في الدقيقة الطرد المركزي لجمع البكتيريا . بعد الطرد المركزي ، supernatants ( بروتين قابل للذوبان ) والأمطار ( إدراج ) تم جمعها على التوالي . تم تنقية السائل طاف ني NTA كروماتوجرافيا الألفة ، البروتين الهدف تم الحصول عليها عن طريق التدرج في عملية الاستخراج .

على النقيض من التصميم التجريبي

مجموعتين من التجارب التي أجريت في السيطرة على المجموعة ( أ ) التقليدية مربع موجة الصعق الكهربائي ( العلامة التجارية ) المستخدمة في التحويل ، ثابت الجهد 2.5kv / سم ، نبض مدة 5 ثوان ، نبض واحد . المجموعة ( ب ) كانت تستخدم طريقة التحويل الكيميائي ( CACL ̀ ) وغيرها من ظروف ثقافة تتفق مع المجموعة التجريبية . الهدف لمقارنة آثار مختلف أساليب التحول على معدل التحويل من البلازميد المؤتلف البروتين الهدف التعبير والنشاط .

4 - النتائج والمناقشات

تحليل كفاءة التحويل الصعق الكهربائي

معدل التحويل كان 8.2 × 10 ⁹ كفو / ميكروغرام ، 41 ٪ أعلى من 5.8 × 10 ⁹ كفو / ميكروغرام في المجموعة ب من 1.5 × 10 ⁶ كفو / ميكروغرام في المجموعة ب ( الشكل 1 ) . عدد النسخ من البلازميد المؤتلف في تحويل الخلايا تم الكشف عنها من قبل مضان الكمية PCR ( fq-pcr ) . وأظهرت النتائج أن عدد النسخ من البلازميد وحيدة في المجموعة التجريبية بنسبة 35 في المائة مقارنة مع مجموعة ، مما يدل على أن موجة مزدوجة التآزر التكنولوجيا يمكن أن تحسن بشكل فعال كفاءة نقل الحمض النووي عبر الغشاء الخارجية . . . . . . . الآلية الأساسية تكمن في : مربع موجة النبض بسرعة إنشاء حقل كهربائي عبر الغشاء للحث على تشكيل غشاء المسام ، أسي موجة النبض باستمرار تحسين توزيع المجال الكهربائي ، وتعزيز الهجرة من بلازميد الحمض النووي إلى السيتوبلازم ، وفي الوقت نفسه تجنب الضرر الذي لا رجعة فيه من غشاء الخلية بسبب موجة مربع واحد . . . . . . .

التعبير عن البروتين للذوبان في التحليل

صفحة الحزب الديمقراطي الصربي الكهربائي أظهرت أن هناك فرق كبير من البروتين الهدف في المجموعة التجريبية بعد 4 ساعات من الحث ، الوزن الجزيئي حوالي 38 كدا ، وهو ما يتسق مع نظرية القيمة . من خلال تحليل imagej البرمجيات ، بروتين قابل للذوبان في المجموعة التجريبية تمثل 65 في المائة من مجموع التعبير ، أعلى بكثير من 42 في المائة في المجموعة و 30 في المائة في المجموعة باء ( الشكل 2 ) . وأظهرت النتائج أن 21.5mg للذوبان البروتيوجليكان الأساسية يمكن الحصول عليها في لتر من الثقافة في المجموعة التجريبية ، 41 ٪ أعلى من 15.2mg في المجموعة و 5 مرات أعلى من 3.8mg في المجموعة باء . في الوقت الحقيقي رصد نبض الطاقة وتقلب ، شرارة كهربائية احتمال أقل من 0.1 في المائة ، والتي يمكن أن تحمي بشكل فعال سلامة الغشاء من الخلايا المستقبلة ، والحد من موت الخلايا في عملية التحويل ، وبالتالي الحفاظ على أعلى النشاط البيولوجي والتعبير القدرة .

4-3 نشاط البروتين وتوصيف هيكل

من خلال طريقة الاليزا ، ملزمة نشاط البروتيوجليكان الأساسية والكولاجين من النوع الأول تم الكشف عن ثابت ملزم ( دينار كويتي ) من تنقية البروتين في المجموعة التجريبية كان 2.3 × 10 ⁻ م ، وهو ما يتسق مع البروتين الطبيعي ( 2.0 × 10 ⁻ م ) . تحليل ديتشرويسم دائرية أظهرت أن α - اللولب المحتوى ، β - مطوية المحتوى كان 32 في المائة ، و 28 في المائة ، و سلامة البنية الثانوية كان أفضل من السيطرة على المجموعة .

5 - التآزر بين المزايا التقنية والمعايير الرئيسية

وينيد جين بولسر X2 يظهر ثلاث مزايا التكنولوجيا الأساسية في هذه الدراسة :

اثنين من موجة التعاون تناسب تماما : وفقا لخصائص جدار الخلية سميكة من بدائيات النوى مثل كولاي ، ذكي التبديل بين موجة مربعة و أسي موجة يدرك التنظيم الدينامي نفاذية الغشاء ، نبض الموجي استجابة المعلمة ميلي ثانية واحدة يضمن درجة عالية من الاستقرار في كفاءة التحويل من دفعات مختلفة ( RSD ≤ 2 في المائة بين دفعات ) .

ذكي نظام ما قبل التحسين يمكن أن تحسن كفاءة : المدمج في قاعدة بيانات e.coli وغيرها من خطوط الخلايا بدائية النواة ، لا تحتاج إلى استكشاف مجموعة من الجهد نبض مرات يدويا ، والانتهاء من التنبؤ المعلمات من سلالة جديدة في 5 دقائق .

تصميم وحدات توسيع نطاق التطبيق : مناسبة لأنّ 96 فتحة لوحة الكهربائي تصميم الخلية ، ودعم تدفق عالية عملة الفرز ، جنبا إلى جنب مع فتح واجهة API ، يمكن أن تعمل على الخط مع أتمتة محطة العمل ، لتلبية متطلبات عملية التنمية على نطاق واسع إنتاج البروتين المؤتلف .

النتائج التجريبية تبين أن هناك علاقة تآزرية صارمة بين القوة الأيونية ، تركيز الخلية و نبض المعلمات . عندما يكون تركيز الخلية أعلى من 1.5 × 10 ⁰ كفو / مل ، نبض الجهد يجب أن تنخفض تلقائيا من خلال وظيفة المقاومة قبل الكشف عن الصك ، وبالتالي تجنب المجال الكهربائي غير موحدة بسبب تجمع الخلايا . تغيير طفيف في تركيز الجلسرين ( ± 1 في المائة ) يمكن أن تعوض في الوقت الحقيقي من خلال نظام المعايرة الذكية ، وضمان كفاءة التحويل مستقرة . هذه التفاصيل تعكس دقة السيطرة على جين نبض X2 في مجمع البيئة التجريبية .

6 - آفاق التطبيق

6-1 تطوير عملية إنتاج البروتين على نطاق واسع

هذه التقنية يمكن تطبيقها مباشرة على الإنتاج الصناعي من البروتيوجليكان الأساسية ، جنبا إلى جنب مع عملية التخمير عالية الكثافة ، وارتفاع تدفق القدرة على تجهيز ( 96 عينات يمكن معالجتها في دفعة واحدة ) من وينيد الصعق الكهربائي ، ومن المتوقع أن تقلل من تكلفة الإنتاج أكثر من 60 ٪ . قوس نظام الحماية و المعلمة التتبع يوفر ضمانة موثوقة لمراقبة الجودة في ورشة عمل برنامج الرصد العالمي ، ويلبي متطلبات صارمة من الأدوية البيولوجية لإنتاج المؤتلف البروتين .

بدائيات التعبير اختراق من الصعب التعبير عن البروتين

تهدف إلى البروتينات المعقدة التي هي غنية في ثاني كبريتيد السندات ، من السهل أن تشكل إدراج الهيئات ، وانخفاض الضرر التحول من الجينات نبض X2 يمكن أن تحسن بشكل كبير من مستوى التعبير للذوبان . . . . . . . على سبيل المثال ، في التعبير عن الأجسام المضادة ، السيتوكينات وغيرها من البروتينات الصيدلانية ، من خلال مسبقا ' prokaryocyte للذوبان في التعبير عن البرنامج ، يمكن إنشاء نظام التعبير السريع ، وتقصير دورة من استنساخ الجينات على نطاق تجريبي الإنتاج .

البيولوجيا التركيبية والجينات التحرير

في مجالات مثل بدائيات التسليم من crispr-cas9 جين تحرير النظام ، وارتفاع تدفق الفرز الهندسة الأيضية سلالات ، وينيد الصعق الكهربائي المزدوج موجة التكنولوجيا التعاونية أظهرت مزايا . عكس قطبية وظيفة مناسبة مع المواد الاستهلاكية متعددة المواصفات ، والتي يمكن أن تلبي متطلبات تسليم أنواع مختلفة من البلازميدات ، الحمض النووي الجينوم ، وحتى الحمض النووي الريبي .

وينيد جين pulser X2 مزدوجة الموجة الصعق الكهربائي أداة إعادة تعريف كفاءة وموثوقية تحويل الخلايا بدائية النواة مع ثورية مزدوجة الموجة التكنولوجيا التعاونية ، ذكي نظام الحماية الرقمية تصميم التفاعل . هذه المعدات قد تم التحقق منها من قبل أكثر من 100 من الشركات الصيدلانية البيولوجية والمختبرات الرئيسية في الصين ، وتوفير خدمة مجانية حصرية المعلمة الأمثل سلالة 7 * 24 ساعة الدعم التقني ، ومساعدة الباحثين على كسر عنق الزجاجة من المؤتلف البروتين التعبير وتسريع تحويل نتائج العلاج الجيني ، والصيدلة البيولوجية وغيرها من المجالات .

المراجع

1 . وانغ يان هونغ . وانغ guiqin ; هاو شياو شيا . بناء نظام التعبير بدائيات النوى البروتيوجليكان [ ي ] ؛ المجلة الصينية الطب السريري . العدد 2003 / 2006

2 . جين يوان تشانغ . لي Jingpeng ; لي هوي دونغ . تشو جيان هونغ . العوامل المؤثرة في بدائيات التعبير المؤتلف هرمون مطلق لموجهة الغدد التناسلية [ ي ] ؛ مجلة كلية المعلمين شيانغتان ( علوم طبيعية ) ؛ العدد 2002 / 2006

3 - لى شياو بو . شياو جينغ . فو روي . مبروك . ( ب ) فيروس سكري بدائيات التعبير وإنشاء إليسا طريقة الكشف [ ي ] ؛ مختبر الحيوان والطب المقارن . العدد 2003 / 2009

4 . شيه شين . تشن مى تشينغ . وانغ يونغ . جيانغ junmei ; رن مينغ جيان . تصميم و ممارسة proteokaryon التعبير في فتح التجارب الجامعية [ ي ] ؛ دليل العلم والتعليم ( zhongxun ) ؛ 29 أيار / مايو 2020

5 . يانغ تاو ، يانغ لى يونيو ، فنغ تشيان جيا تشنغ نيو ليانغ ، نيو بو الإنسان عامل النمو الكبدية ألفا بدائيات التعبير البناء والتعبير [ ي ] ؛ الصينية مجلة علم الأحياء الدقيقة والمناعة . الفترة 2004-2004

6 - ما lingling ; ما هونغ مى . وو شوانغ . وانغ دونغ . لي يونغ . ما chenjie ; تسنغ جين . بدائيات التعبير عن الكلوستريديم برفرنجنز السم β 1 ووضع طريقة غير مباشرة اليسا للكشف عن الأجسام المضادة [ ي ] ؛ الصينية مجلة علم الأحياء الدقيقة . العدد 2002 / 12

7 - اغنية تاو . لى وى تاو . بنغ تشينغ . تشن هونغ . ني سو مي . الاستنساخ و بدائيات التعبير عن الجينات معطف البروتين من فيروس تبرقش فول [ ي ] ؛ انهوى للعلوم الزراعية ؛ العدد 2013

8 - تشونغ يو لينغ . باسم الدولة . دو وي وي . تشانغ هوا ون . لي تشون . شي huaiping ; [ ي ] ؛ الفترة 2022-2002

9 - وانغ qiongxiu ; تشو جينغ . تنقية البروتين عامل نخر الورم الخلايا ذات حمل يجند بدائيات التعبير بواسطة التبادل الأيوني اللوني [ ي ] ؛ الصين صيدلية ; العدد 2010

10 - اغنية شو مي شو تشنغ ، للذوبان في التعبير عن مستقبلات عامل نمو بطانة الأوعية الدموية على تثبيط نشاط عامل نمو بطانة الأوعية الدموية [ ي ] ؛ مجلة الطب الصيني التقليدي ؛ الفترة 2003-2000