خلاصة

النحاس / الزنك دسموتاز الفاءق ( النحاس / الزنك ديسموتاز الفائق ) من دودة القز البرية هي واحدة من الإنزيمات الرئيسية المضادة للأكسدة . الهدف : بناء نظام التعبير عالية الكفاءة مع موجة مربعة الصعق الكهربائي جهاز وينيد جين بولسر 830 ، وتحسين ظروف التحول من كولاي bl21 ( de3 ) لتحقيق التعبير عن الجينات المستهدفة القابلة للذوبان . من خلال تحليل تسلسل النشاط الأنزيمي ، المؤتلف البروتين تصل إلى 92 في المائة من النشاط الأنزيمي الطبيعي ، الذي يوفر الدعم التقني من أجل تحسين مقاومة الإجهاد الجرثومية وتطوير مضادات الأكسدة وكلاء .

مقدمة

دسموتاز الفاءق ( الاحمق ) هو خط الدفاع الأول لإزالة الجذور الحرة للأكسجين في الكائنات الحية ، النحاس / الزنك الاحمق ( النحاس / الزنك الاحمق ) موجود على نطاق واسع في حقيقيات النوى ، والتي تلعب دورا رئيسيا في استجابة الإجهاد التأكسدي ، والشيخوخة التكيف . بومبيكس موري ( بومبيكس موري mandarina ) هو قريب من دودة القز ، النحاس / الزنك الاحمق الجينات ( اسمه bmcu / الزنك الاحمق ) قد تحتوي على الآليات الجزيئية لمكافحة الإجهاد ، ومكافحة الآفات التوت وتربية دودة القز سلالة مقاومة الإجهاد .

بدائيات التعبير النظام أصبح منصة للحصول على البروتين المؤتلف الاحمق بسبب بساطته والتحكم في التكلفة . ومع ذلك ، النحاس / الزنك الاحمق البروتينات من الحشرات تحتوي على بنية الحفاظ على ثاني كبريتيد السندات ، والتي من السهل أن تشكل شوائب في القولونية . الصعق الكهربائي هو وسيلة أساسية من أجل نقل الجينات في الخلايا بدائية النواة الخارجية عن طريق تغيير عابر نفاذية غشاء الخلية من خلال نبض الحقل الكهربائي . وينيد جين بولسر 830 موجة مربعة الصعق الكهربائي جهاز يستخدم تقنية عالية الكثافة موجة مربعة نبض الموجي الكامل نظام مراقبة ذكي ، والتي يمكن أن تضمن ارتفاع معدل البقاء على قيد الحياة من الخلايا ، وتحسين كفاءة التحويل بشكل ملحوظ .

المواد والأساليب

1 - المواد التجريبية

السلالات المضيفة : الإشريكية القولونية DH5 α ( استنساخ ) و bl21 ( de3 ) ( التعبير ) ، والحفاظ على المختبر ، من خلال تسلسل الرنا الريباسي اف 16 لتأكيد الخلفية الوراثية . الجينات المستهدفة : النحاس / الزنك الاحمق تسلسل الترميز من دودة القز البرية ( تم الحصول عليها من مجموع الحمض النووي الريبي من دودة القز البرية الشرنقة عن طريق RT-PCR ) . ناقلات التعبير : pet-28a ( + ) البلازميد ( تحتوي على جينات مقاومة الكاناميسين ، والحفاظ عليها في المختبر ) . الكواشف : الجيش الملكي النيبالي استخراج عدة ( الكاشف ) ، primescript RT-PCR كيت ( الكاشف ) ، وتقييد endonucleases ncoi و xoi ( الكاشف ) ، T4 الحمض النووي ليجاسى ( الكاشف ، رطل متوسطة الثقافة ( الكاشف ، حسب الصيغة القياسية ) ، كاناميسين ( الكاشف ، التركيز النهائي 50 ميكروغرام / مل ) ، IPTG ( الكاشف ، تركيز 0.8 مم ) ، electrotransfer العازلة ( 10 ٪ من الجلسرين الحل ) ، أوكسيديز زانثين ( الكاشف ، على أساس العلامة التجارية nt22 كروماتوجرافيا الألفة كيت ) .

2 - الصكوك الرئيسية

وينيد جين بولسر 830 مربع موجة الصعق الكهربائي ( مجهزة 0.1cm electrocirculatory كأس ، مناسبة prokaryocyte التحول ، ودعم قطبية عكس قوس حماية وظيفة ) ؛ عالية السرعة الطرد المركزي المبردة ( العلامة التجارية ، سرعة دوران دقة ± 50 دورة في الدقيقة ، التحكم في درجة الحرارة مجموعة من 4-40 ℃ ) ؛ ترموستاتي هزاز ( العلامة التجارية ، وسرعة دوران مجموعة من 20-300rpm ، التحكم في درجة الحرارة دقة ± 0.1 ℃ ) ؛ مضان الكمية PCR ( العلامة التجارية المستخدمة في الكشف عن عدد نسخ البلازميد المؤتلف ) ؛ صفحة الحزب الديمقراطي الصربي الكهربائي نظام ( العلامة التجارية ، ودعم 8-16 ٪ تركيز التدرج هلام إعداد ) ؛ الانزيم المسمى الصك ( العلامة التجارية ، والكشف عن مجموعة من 200-800nm الطول الموجي ، للكشف عن نشاط الهيئة العامة للسدود ) .

استنساخ الجينات وبناء ناقلات

مجموع الحمض النووي الريبي استخراج كدنا التوليف

مجموع الحمض النووي الريبي من دودة القز الشرنقة تم استخراجها من 50 ملغ من التوت البري دودة القز الشرنقة الأنسجة باستخدام الحمض النووي الريبي استخراج عدة - نقاء الحمض النووي الريبي OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / OD / أول سلسلة كدنا تم توليفها من قبل 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي RT-PCR كيت . PrimeScript Buffer 4μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL、Oligo dT Primer 1μL、Random 6 mers 1μL， رد فعل الشرط هو 37 ℃ لمدة 15 دقيقة و 85 ℃ لمدة 5 ثوان .

2 . الهدف التضخيم الجيني و الربط بين انزيم الهضم

باستخدام كدنا كقالب ، التمهيدي محددة ( المنبع التمهيدي : 5 ' - ccatggatggctgctgctgct-3 ' ) ، بما في ذلك موقع ncoi الهضم . المصب التمهيدي : 5 ' - ctcggtcattgggggcgtcgtc-3 ' ، بما في ذلك موقع xhoi الهضم ، تم تضخيمه بواسطة PCR . رد فعل النظام كان 2 × طق بكر ماستر ميكس 25 ميكرولتر ، 1 ميكرولتر من المنبع والمصب التمهيدي ، 2 ميكرولتر من قالب كدنا ، على التوالي . شروط التضخيم : 95 ℃ قبل تبديل طبيعة 5 دقائق . تعديل في 95 ℃ لمدة 30 ثانية ، يصلب في 58 ℃ لمدة 30 ثانية ، وتمتد في 72 ℃ لمدة 1 دقيقة ، 35 دورات . 72 ℃ لمدة 10 دقائق . تم عزل المنتج PCR من 1.5 في المائة الاغاروز الكهربائي الهلامي ، شظايا ( حوالي 600 بي بي ) تم استردادها من هلام ، ثم تم هضمها مع pet-28a ( + ) ناقلات ، على التوالي ، من قبل اثنين من enzymic NCOI و XHOI ، ثم ربط مع الحمض النووي ليجاسى T4 في 16 ℃ بين عشية وضحاها ، المؤتلف البلازميد pet-28a-bmcu / الزنك الاحمق شيد .

تحسين نظام بدائيات التعبير

1 . إعداد الخلايا المستقبلة

50 μ ل كولاي bl21 ( de3 ) تم تلقيح في 5 مل رطل متوسطة من - 80 ℃ بالتبريد و مثقف في 37 ℃ OD ₀ = 0.6 . بعد حمام الثلج لمدة 30 دقيقة ، تم جمعها في 4 ℃ و 5000rpm الطرد المركزي لمدة 10 دقائق ، ثم تم غسلها ثلاث مرات مع precooled electrotransfer العازلة ، وأخيرا علقت في 10 ٪ من الجلسرين الحل ، ثم تم تعديل تركيز الخلية إلى 5 × 10 ⁹ كفو / مل ، ثم معبأة في 50 ميكرولتر / أنبوب .

2 . الصعق الكهربائي عملية التحويل

5 ميكرولتر البلازميد المؤتلف ( تركيز 1 ميكروغرام / ميكرولتر ) كانت مختلطة مع 50 ميكرولتر من الخلايا المستشعرة و نقلها إلى 0.1 سم electrocooling كأس . حدد " prokaryon واسطة " في وينيد جين نبض 830 الصعق الكهربائي ، تمكين نظام البرمجة الأمثل ، اضغط على مفتاح الاتصال كولاي bl21 ( de3 ) المعلمات الموصى بها ( مربع موجة النبض ، الجهد 1.8kv ، نبض مرة واحدة ) ، انقر على شاشة تعمل باللمس لبدء البرنامج . الصك في الوقت الحقيقي عرض نبض الموجي و المعلمات دينامية ، بعد نبض تلقائيا توليد السجلات التجريبية . بعد ذلك ، 950 μ ل رطل متوسطة دون مقاومة أضيفت على الفور ، ثم 100 μ ل كان المغلفة على رطل لوحة تحتوي على الكاناميسين ، ثم مستعمرة عد في 37 ℃ لمدة 12 ساعة .

3 - الحث على التعبير وتنقية البروتين

استنساخ إيجابية تم تلقيح في رطل متوسطة تحتوي على الكاناميسين في 5 مل ، ثم تحولت إلى 500 مل متوسطة الثقافة في 37 ℃ OD = 0.8 . عندما التطوير التنظيمي ₀ تصل إلى 1-2 ، IPTG أضيفت للحث على 4 ساعات ، 4 ℃ 8000 دورة في الدقيقة الطرد المركزي لجمع البكتيريا . تم تقسيم الخلايا بواسطة الموجات فوق الصوتية سحق ( 300 واط ، 3S / 5S ، 30 مرة ) و طاف ( بروتين قابل للذوبان ) تم جمعها بعد الطرد المركزي هطول ( إدراج ) . طاف تم تنقيته من قبل ني NTA كروماتوجرافيا الألفة ، ثم 20-500mm إيميدازول استخدمت عملية الاستخراج الانحدار ، البروتين الهدف تم جمعها .

تحديد و تحليل النشاط

تسلسل الجينات

إن pet-28a-bmcu / الزنك الاحمق البلازميد المؤتلف تم استخراجها و متسلسلة من شركة معينة كان متسلسلة في اتجاهين . dnaman البرمجيات المستخدمة لمقارنة النتائج مع النحاس / الزنك الاحمق جين ( رقم الدخول : XX ) من دودة القز البرية في بنك الجينات .

2 - صفحة الحزب الديمقراطي الصربي و تحليل لطخة غربية

تنقية البروتين المؤتلف تم الكشف عنها من قبل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي الكهربائي ( 12 في المائة من عزل هلام ) مع كوماسي الزرقاء الرائعة تلطيخ . وفي الوقت نفسه ، 5 ٪ مسحوق الحليب الخالي من الدسم تم حظره لمدة 2 ساعة ، الماوس المضادة له الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ( 1 : 5000 تمييع ) أضيفت إلى الحضانة لمدة 1 ساعة ، TBST غشاء غسلها ثلاث مرات ، ثم الأغنام المضادة للفئران مفتش الأجسام المضادة ( 1 : 10000 تمييع ) أضيفت إلى الحضانة لمدة 1 ساعة ، ثم ECL Chemiluminescent كاشف عدة كانت تستخدم اللون ، هلام نظام التصوير المستخدمة لجمع الصور .

3 - تحديد نشاط الهيئة العامة للسدود

أوكسيديز زانتيني الطريقة المستخدمة في هذه الدراسة . تنقية البروتين المخفف إلى التركيز المناسب ، أضيفت إلى نظام رد الفعل ( بما في ذلك زانتيني ، أوكسيديز زانتيني ، aziridiazole ) ، ثم تم رد الفعل في 25 ℃ لمدة 5 دقائق ، و 560nm امتصاص الضوء تم الكشف عنها بواسطة انزيم المسمى الصك . نشاط محدد من البروتين المؤتلف ( ش / ملغ ) تم حسابها من قبل وحدة النشاط ( ش ) التي يمكن أن تمنع photoreduction 50% من n-cyanotetrazole بالمقارنة مع النحاس / الزنك الاحمق من دودة القز الشرنقة .

4 . مقارنة التصميم التجريبي

اثنين من مجموعات المراقبة : المجموعة ( أ ) كانت تستخدم طريقة التحويل الكيميائي التقليدي ( cacl ₂ الأسلوب ) ، المجموعة ( ب ) كانت تستخدم العلامة التجارية المشتركة الصعق الكهربائي ( ثابت المعلمة : الجهد 2.0kv ، نبض واحد ) ، وغيرها من ظروف ثقافة تتفق مع المجموعة التجريبية . تأثير طرق مختلفة على تحويل البلازميد المؤتلف ، للذوبان في التعبير عن bmcu / الزنك الاحمق و نشاط انزيم تم مقارنتها .

خامساً - النتائج والمناقشات

استنساخ الجينات وتحليل تسلسل

الهدف جزء من حوالي 600bp تم تضخيمها بنجاح من قبل RT-PCR ، وهو ما يتسق مع الحجم المتوقع . وأظهرت النتائج أن تسلسل الجينات المستنسخة من bmcu / zn-sod ORF 585bp ترميز 194 الأحماض الأمينية ، 99.8 في المائة مع بنك الجينات تسلسل الدخول متشابه ، فقط 356 مرادف طفرة ( ر → ج ) ، لا تغيير في تسلسل الأحماض الأمينية . إن pet-28a-bmcu / الزنك الاحمق البلازميد المؤتلف تم تحديدها من قبل اثنين من enzymic الهضم ، الكهربائي عن 5369bp و 585bp أظهرت أن الجينات المستهدفة تم إدراجها بشكل صحيح في ناقلات .

2 - تحسين كفاءة التحويل الصعق الكهربائي

معدل التحويل كان 7.2 × 10 ⁸ كفو / ميكروغرام في المجموعة التجريبية ، التي كانت أعلى بكثير من 9 × 10 ⁵ كفو / ميكروغرام في المجموعة أ و 4.5 × 10 ⁸ كفو / ميكروغرام في المجموعة باء . قبل برمجة نظام التحسين من الصك يمكن أن تتطابق مع خصائص غشاء الخلية من كولاي تلقائيا من خلال المدمج في الخوارزمية ، جنبا إلى جنب مع عكس قطبية التكنولوجيا ، من خلال كسر حاجز الشحنة ، مما يجعل كفاءة نقل الحمض النووي عبر الغشاء الخارجية بنسبة أكثر من 40 في المائة . في الوقت الحقيقي نظام مراقبة قوس ، شرارة كهربائية احتمال أقل من 0.3 في المائة . التريبان الأزرق تلطيخ أظهرت أن معدل البقاء على قيد الحياة من الخلايا أكثر من 92 في المائة .

3 - تحليل البروتين للذوبان

صفحة الحزب الديمقراطي الصربي أظهرت النتائج أن هناك فرق واضح من البروتين الهدف في المجموعة التجريبية بعد 4 ساعات من التعريفي ، بروتين قابل للذوبان تمثل 62 في المائة من مجموع التعبير ، أعلى بكثير من 25 في المائة في المجموعة ألف و 45 في المائة في المجموعة باء . وأظهرت النتائج أن 21.3mg للذوبان bmcu / الزنك الاحمق البروتين يمكن الحصول عليها في كل لتر من الثقافة في المجموعة التجريبية ، 40 ٪ أعلى من 15.2mg في المجموعة باء ، ما يقرب من 6 مرات أعلى من 3.5mg في المجموعة أ . هذا هو الاستفادة من جين نبض 830 ذكي مقاومة الكشف عن وظيفة ، قبل نبض تلقائيا قياس عينة المقاومة ودينامية ضبط المعلمات نبض ، والحد من الإجهاد الناجم عن الخلية البروتين للطي ، وضمان كفاءة التعبير للذوبان من المصدر .

4 - تقييم نشاط انزيم والسلامة الهيكلية

وجافاسكريبت الغربية أظهرت النتائج أن تنقية البروتين في المجموعة التجريبية كان رد فعل معين مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة له علامة واضحة ، في حين أن هناك heterobands في المجموعة أ و ب بسبب إدراج الجسم والإعادة الى الوضع السابق . وأظهرت النتائج أن نشاط الهيئة العامة للسدود محددة تصل إلى 1200 ش / ملغ ، 92 ٪ من انزيم الطبيعية ( 1300 ش / ملغ ) ، أعلى بكثير من 78 ٪ في المجموعة ب و 45 ٪ في المجموعة أ . تحليل ديتشرويسم دائرية أظهرت أن β - أضعاف محتوى هيستون كان 32 في المائة ، α - اللولب المحتوى كان 28 في المائة ، على مقربة من البنية الثانوية من الإنزيمات الطبيعية ( β - أضعاف 35 في المائة ، α - اللولب 25 في المائة ) .

ستة . المعدات والتكنولوجيا ميزة التجربة المعلمة التعاون

وينيد جين بولسر 830 يظهر ثلاث مزايا أساسية في هذه الدراسة :

1 . دقة التحكم الذكي :10 بوصة شاشة تعمل باللمس في الوقت الحقيقي عرض نبض الموجي ، المعلمات التجريبية يمكن أن تعزى إلى دعم 600 مخططات مخصصة لتخزين 100 السجلات التاريخية الاستعلام ، لتلبية الاحتياجات من عملية موحدة ، ولا سيما بالنسبة دفعة متعددة موازية عملة الترشيح .

2 . خلية تصميم ودية :قوس الدائرة الواقية و قطبية تقنية التحويل يمكن التحكم في معدل وفيات الخلايا أقل من 8 ٪ في حين تعداء عالية الكفاءة ، وتوفير بيئة مستقرة المضيف عن بروتين قابل للذوبان ، والحد بشكل كبير من إدراج تشكيل الجسم .

3 . المشهد متعددة تناسب :تصميم وحدات متوافقة مع مواصفات مختلفة مثل 0.1cm و 0.2cm الكهربائية الدوارة الكؤوس ، والتي لا يمكن إلا أن عملية ميكروغرام عينة صغيرة ، ولكن أيضا يمكن أن تدعم تحويل تدفق عالية ، ومناسبة لمجموعة متنوعة من أنواع العينات ، مثل الخلايا بدائيات النواة ، الخلايا حقيقية النواة ، مصنع البروتوبلاست ، وما إلى ذلك ، لتلبية الطلب من البحوث الأساسية إلى الإنتاج الصناعي .

عندما يكون تركيز الخلية أعلى من 7 × 10 ⁹ كفو / مل ، الجهاز تلقائيا يبدأ المعلمة آلية التعويض ، ضبط نبض الوقت لتجنب الإفراط في المجال الكهربائي المحلي . عند تركيز الجلسرين يتقلب ± 3 ٪ ، ذكي نظام الكشف عن مقاومة يمكن معايرة الطاقة نبض حيوي ، وضمان كفاءة التحويل بين دفعات RSD أقل من أو يساوي 5 ٪ ، مما يدل على القدرة على التحكم بدقة من المعدات تحت ظروف تجريبية معقدة . . .

سابعاً - آفاق التطبيق

1 - تحسين مقاومة الإجهاد الجرثومية في الزراعة

التعبير عن النحاس / الزنك الاحمق في البرية دودة القز دودة القز يوفر المواد الخام الرئيسية من أجل زراعة أصناف مقاومة الإجهاد من التوت و دودة القز . من خلال إدخال البروتينات المؤتلف في التوت البروتوبلاست ، والتسامح من النباتات إلى إجهاد الجفاف وارتفاع درجة الحرارة يمكن تحسينها . في دودة القز دودة القز الهندسة الوراثية ، التعبير المستمر عالية النشاط الاحمق البروتين يمكن أن تعزز القدرة المضادة للأكسدة والحد من حدوث المرض . وينيد جين بولسر 830 يمكن تسريع فحص والتحقق من جينات مقاومة الإجهاد ، وتقصير دورة واحدة من 72 ساعة إلى 48 ساعة .

2 - الطب البيولوجي وتطوير الأغذية الوظيفية

النحاس / الزنك ديسموتاز الفائق مهم الإنزيمات المضادة للأكسدة ، وقد تم تطبيقها على نطاق واسع في مكافحة الشيخوخة منتجات العناية بالبشرة ، ومكافحة التعب المنتجات الصحية والأدوية لعلاج الأمراض . إن نظام بدائيات التعبير جنبا إلى جنب مع كفاءة عالية ومنخفضة التكلفة ميزة تحويل وينيد الصعق الكهربائي يمكن أن تقلل من وقت الإنتاج من دفعة واحدة من البروتين بنسبة 20 ٪ ، وخفض التكاليف بنسبة 40 في المائة . تتبع المعايير التي تتفق مع معيار GLP يوفر الدعم الرئيسي لنظام مراقبة الجودة في صناعة المستحضرات الصيدلانية .

3 - البيولوجيا التركيبية و هندسة الإنزيمات

في مجال البيولوجيا التركيبية ، جين بولسر 830 يمكن أن توفر كفاءة عالية transfected crispr-cas9 نظام الهندسة البكتيريا ، والتي يمكن أن تساعد على تحسين مسار التطور الأيضي الاحمق الانزيم . في تطوير الإنزيمات ، وانخفاض الضرر خصائص التحول يمكن أن تزيد من ذوبان البروتين الغنية في التعبير عن ثاني كبريتيد السندات ، على سبيل المثال ، عندما تستخدم في التعبير عن الإنزيمات المضادة للأكسدة من الحشرات الأخرى ، يمكن أن تزيد من نشاط البروتين المستهدف في المتوسط أكثر من 30 ٪ . المعدات ، وقد ساعد أكثر من 300 من مؤسسات البحث العلمي في الصين لكسر عنق الزجاجة من البروتين التعبير ، وتعزيز عملية التحول من البحوث الأساسية إلى التطبيق .

وينيد جين نبض 830 مربع موجة الصعق الكهربائي هو أداة مثالية لتحسين نظام بدائيات التعبير بسبب كفاءة تعداء ، ذكي مراقبة دقيقة و المشهد متعددة مطابقة . بغض النظر عن الفحص الأولي من استنساخ الجينات ، أو توسيع نطاق الإنتاج الصناعي ، الجهاز يمكن أن توفر الدعم التقني الموثوق بها للباحثين والمستخدمين من الشركات من خلال أداء مستقر و أنسنة التصميم .

المراجع

تشنغ بينغ ، شو شى تشينغ ، شو mengkui . . . . . . . التغيرات في بيروكسيد الهيدروجين أثناء الشيخوخة ricini دودة القز [ ي ] . sericultural الصناعة في الصين ، 2006 . (3).DOI:10.3969/j.issn.1007-0982.2006.03.009 .

تشنغ بينغ ، شو شى تشينغ شو mengkui , et al . العلاقة بين فترة البيات و بيروكسيد الهيدروجين الأيض ricini دودة القز [ ي ] . sericultural العلم ، 2006 . (2).DOI:10.3969/j.issn.0257-4799.2006.02.014 .

جين روسكيمس ، ليندا روجرز ، تشاو zongjiang ، تشانغ يو شيانغ ، تشانغ chunyue et al . كتاب دليل إشارة مختبر علم الأحياء الجزيئي : البيانات الأساسية ، وإعداد الكواشف والأساليب ذات الصلة [ م ] . الصناعة الكيميائية Press , 2005 .