ليزر متحد البؤر المسح المجهر

TCS SP8 DLS لايكا ليزر متحد البؤر المسح المجهر يجمع بين مزايا اثنين من أنظمة التصوير : استخدام لايكا TCS SP8 DLS ( الرقمية ضوء ورقة ) ، يمكنك استخدام لينة الإضاءة المستوية واحدة لتحقيق التركيز على المجهر . من خلال تطوير twinflect العاكس ، ونحن يمكن أن تجعل من السهل استخدام متعدد الوظائف ضوء المجهر مع التركيز المشترك منصة لايكا TCS SP8 .

لايكا ليزر متحد البؤر المسح المجهر ( على سبيل المثال ، لايكا SP8 ، ستيلاريس سلسلة ) هو نظام التصوير ثلاثي الأبعاد عالية الدقة ، والتي يتم تطبيقها على نطاق واسع في مجالات الطب الحيوي ، علم المواد ، وهلم جرا . هذه العملية يجب أن تكون جنبا إلى جنب مع البصريات ، ليزر التحكم ومعالجة الصور .

إعداد قبل العملية

1 - التفتيش على البيئة والمعدات

المتطلبات البيئية :

غرفة مظلمة مستقلة أو تظليل البيئة ، وتجنب الضوء الخارجي تدخل إشارة الفلورسنت .

التحكم في درجة الحرارة في 20-25 درجة مئوية ، الرطوبة أقل من أو يساوي 60 ٪ ، ومنع عدسة التكثيف أو فشل الدائرة .

معدات التفتيش :

تأكد من أن الليزر ( على سبيل المثال ، 405nm 488nm , 561nm , 633nm ) حالة المؤشر العادي ( الأخضر هو على استعداد ) .

تأكد من أن الهدف ( على سبيل المثال ، 10x / 0.3 ، 20x / 0.75 ، 63x / 1.4 النفط مرآة ) نظيفة و تتحرك بسلاسة .

بدوره على نظام التبريد ( على سبيل المثال ، ليزر تبريد المياه ) لضمان استقرار درجة الحرارة في مجموعة ( عادة 18-22 ℃ ) .

2 - إعداد العينات

عينة بيولوجية

الخلايا الحية تحتاج إلى أن تكون مثقف في طبق بتري ( على سبيل المثال ، مختبر تيك الثاني ) مع التركيز الخاص لتجنب صعوبة التركيز بسبب استخدام الشريحة العادية .

شرائح الأنسجة الثابتة يجب أن تكون مختومة من قبل antifluorescence التبريد أقراص ( على سبيل المثال ، prolong الذهب ) مع سمك أقل من 20 ميكرومتر .

عينات المواد :

عينة شفافة يجب أن تكون مصقولة إلى خشونة السطح را < 0.1 μ م ، عينة شفافة ( مثل البوليمر ) يجب تجنب التدخل من تألق ذاتي .

متطلبات وضع العلامات :

صبغة الفلورسنت يجب أن تكون مطابقة مع الليزر الطول الموجي ( على سبيل المثال ، dapi متحمس 405nm ، اليكسا floor 488 متحمس 488nm ) .

عند وضع العلامات متعددة الألوان ، لا تتداخل مع طيف الانبعاث الصبغ ( إشارة يمكن فصلها عن طريق القرار الطيفية وظيفة ) .

العمليات الأساسية

1 . بدء التشغيل و التهيئة

بدء تسلسل :

بدوره على إجمالي الطاقة → 2 . بدء تشغيل نظام تبريد الليزر → 3 . بدوره على المجهر . بدء تشغيل برامج التحكم ( مثل لاس العاشر أو ستيلاريس جناح ) .

برامج الفحص الذاتي :

البرنامج تلقائيا بالكشف عن وحدات مثل الليزر ، مسح الرأس ، كائن الجدول ، وما إلى ذلك ، يؤكد أن الدولة هي " جاهزة " .

تشغيل " التحقق من اليومية " وظيفة لمعايرة مسار الضوء و نظام الكشف عن الحساسية ( مثل PMT كسب قوة الليزر ) .

2 . عينة التعريب والتركيز

معاينة مرآة منخفضة الطاقة :

اختيار 10x مرآة الهواء ، إيقاف تشغيل الليزر ، واستخدام الضوء المرسل ( مثل مصباح هالوجين ) لتحديد موقع منطقة العينة بسرعة .

الانتقال إلى موقع الهدف عن طريق الناقل س ص مقبض الباب أو برامج الملاحة وظيفة .

تركيز متحد البؤر

بدوره على 488nm الليزر ( الطاقة المنخفضة ، على سبيل المثال ، 5 ٪ ) ، اختر " لايف " واسطة لمشاهدة في الوقت الحقيقي .

ضبط Z - المحور السائر المحركات ، واستخدام " التركيز النهائي " أداة التركيز تدريجيا حتى إشارة مضان قوية .

عند التبديل عالية الطاقة عدسة الهدف ( على سبيل المثال ، 63x النفط عدسة ) ، خاصة غمر النفط ( على سبيل المثال ، نوع و النفط ) ينبغي أن تضاف بين عدسة الهدف و تغطية الشريحة .

3 . الحصول على صورة إعدادات المعلمة

قوة الليزر مع كسب PMT :

قوة الليزر : زيادة تدريجية من 1 ٪ لتجنب التبييض الخفيفة ( عادة أقل من 20 ٪ ) .

PMT كسب : ضبط قوة الإشارة بين 100-800 ( 12bit الصورة ) ، وتجنب التشبع ( > 4095 ) .

مسح المعلمات :

القرار : اختيار 512 * 512 ( معاينة سريعة ) أو 2048 * 2048 ( التصوير عالية الدقة ) حسب الطلب .

سرعة المسح الضوئي : خط متوسط عدد 1-4 مرات ( زيادة الضوضاء ) ، في إطار متوسط عدد 1-8 مرات ( خلية حية دينامية التصوير النقصان ) .

حجم الثقب : عادة 1 وحدة الهواء ( الاتحاد الافريقي ) ، والتوازن بين القرار و نسبة الإشارة إلى الضوضاء .

إعدادات الطيف :

عند وضع علامة متعددة الألوان ، طيف الانبعاث من العينة الممسوحة ضوئيا في " لامبدا المسح " واسطة ، و الطول الموجي مجموعة ( على سبيل المثال : 410-480nm دابي ، اليكسا تدفق 488 : 500-550nm ) .

4 - التصوير ثلاثي الأبعاد و السلاسل الزمنية

ض محور التراص :

مجموعة بداية / نهاية الموقف و طول الخطوة ( على سبيل المثال ، 0.5 μ م ) ، البرنامج تلقائيا يأخذ صور متعددة الطبقات و يجمع بين نموذج ثلاثي الأبعاد .

السلسلة الزمنية

عند تصوير الخلايا الحية ، تعيين الفاصل الزمني ( على سبيل المثال ، في إطار واحد كل 30 ثانية ) ومجموع عدد الإطارات ( على سبيل المثال ، 100 إطارات ) لتسجيل عملية دينامية .

تمكين " autofocus " وظيفة للحفاظ على التركيز مستقرة ، وتجنب إزالة التباؤر الناجم عن حركة الخلية .

ليزر متحد البؤر المسح المجهر ، ليزر متحد البؤر المسح المجهر

1 . ضوء ورقة نمط الإضاءة

فائدة نموذج مناسبة لأنّ سريعة ومنخفضة السمية الخفيفة التصوير من عينات سميكة ( مثل الزرد الأجنة ) .

خطوات التشغيل :

التبديل إلى لوحة وحدة ضبط الإضاءة لوحة سمك ( عادة 2-5 ميكرون ) .

وضع كاميرا مزدوجة متزامن جمع ( على سبيل المثال ، نقل الضوء الفلورية إشارة ) .

من خلال " عرض متعددة " وظيفة متعددة زاوية الصورة فسيفساء ، وإعادة بناء هيكل ثلاثي الأبعاد .

2 . فائقة الدقة التصوير ( مثل الأمراض المنقولة جنسيا )

من خلال كسر الحد حيود ، القرار هو 20-50nm . . . . . . .

نقاط التشغيل :

الهدف الخاص STED ( على سبيل المثال ، 100x / 1.4 النفط مرآة ) و depletion الليزر ( على سبيل المثال ، 592nm ) المستخدمة .

ضبط قوة الليزر Depletion ( عادة 50-200mW ) ووضع قناع المرحلة ( مثل 2D أو 3D STED ) .

بعد أخذ العينات ، deconvolution تتم باستخدام " Huygens " أو " الرعد " البرمجيات .

3 - القرار الطيفية الخطية deconvolution

فصل تداخل الإشارات عند وضع علامات متعددة الألوان :

أطياف الانبعاث من العينات التي تم الحصول عليها في " لامبدا المسح " واسطة .

تحميل البيانات الطيفية في " الطيف " أداة البرمجيات تلقائيا بحساب كل قناة نقية إشارة .

ضبط عتبة لإزالة الضوضاء في الخلفية ، حفظ الصورة بعد الانقسام .

رابعاً - الصيانة والصيانة

1 . التنظيف اليومي

المكونات البصرية :

إزالة الغبار من سطح العدسة الشيئية و فلتر مع نفخ بالون ، ومنع مسحة القطن أو منشفة ورقية من المسح المباشر .

إذا كنت بحاجة إلى تنظيف ، تراجع في كمية صغيرة من الكحول ( أو سائل التنظيف الخاصة ) مع عدسة ورقة ، وفرك بلطف في دوامة .

مرحلة التحميل وعينة بن :

مسح مع مكافحة ساكنة القماش ، وتجنب النفط المتبقي أو ختم أقراص .

2 - صيانة الليزر

استخدام القيود :

تعمل باستمرار لمدة لا تزيد عن 8 ساعات ، وتجنب الأضرار الناجمة عن ارتفاع درجة حرارة أنبوب الليزر .

عند إيقاف تشغيل الجهاز ، يتم تقليل قوة الليزر إلى 1 ٪ ، ثم التبديل قبالة .

رصد مدى الحياة :

الحياة المتبقية ( على سبيل المثال ، 488nm الليزر عادة ما تكون أكثر من 20 ، 000 ساعة ) في واجهة البرنامج " حالة الليزر " .

عندما تقترب من نهاية الحياة ، اتصل لايكا مقدما لاستبدال أنبوب الليزر .

3 - المعايرة الدورية

مسار الضوء المعايرة :

المواءمة بين المحور البصري و الثقب يتم معايرة كل ثلاثة أشهر باستخدام معيار الفلورسنت المجهرية ( على سبيل المثال ، tetraspeck ) .

المعايرة الميكانيكية :

س ص / ض محور الدقة ( خطأ ينبغي أن يكون أقل من 0.1 μ م ) ينبغي تفتيشها في كل عام .

خامساً - حل المشاكل المشتركة

صورة لا إشارة

التحقق من ما إذا كان الليزر هو تحول ، PMT كسب > 0 ، إذا كان مرشح مباراة ( على سبيل المثال ، يحيل بها مرشح كتلة إشارة ) .

طمس الصورة

التحقق من ما إذا كان الهدف هو غمر النفط كافية ، ما إذا كان الثقب هو تحول ، ما إذا كانت العينة على نحو سلس ( على سبيل المثال ، الخلية الحية نتوءات تسبب التباؤر ) .

قوة الليزر الاستقرار

تنظيف نافذة الخروج من الليزر ، والتحقق من أن نظام التبريد درجة حرارة المياه في مجموعة ( على سبيل المثال ± 0.5 ℃ ) .

برامج كاتون

إغلاق البرامج الكبيرة الأخرى ، والحد من دقة الصورة أو سرعة المسح الضوئي ، أو زيادة ذاكرة الكمبيوتر ( يوصى ≥ 32 غيغابايت ) .

ليزر متحد البؤر المسح المجهر ، ليزر متحد البؤر المسح المجهر

الليزر الأمن :

ارتداء نظارات واقية من الليزر أثناء العملية ( الطول الموجي يجب أن تغطي جميع خطوط الليزر المستخدمة ) .

لا تنظر مباشرة إلى أشعة الليزر أو الضوء المنعكس ، وتجنب التعرض الطويل الأمد إلى الجلد ليزر عالية الطاقة ( مثل > 50mW ) .

السلامة البيولوجية

عند التعامل مع الخلايا الحية أو مسببات الأمراض ، تعمل في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لمنع تلوث العينة .

السلامة الكيميائية

عند استخدام المذيبات العضوية ( مثل الإيثانول ) لتنظيف ، تعمل في خزانة التهوية لتجنب استنشاق الغازات المتطايرة .