مجموعة استنساخ خطوة واحدة سريعة

شروط التخزين والنقل :-20℃

تكوين المنتج :مجموعة استنساخ خطوة واحدة سريعة

ملخص المنتج

مجموعة استنساخ خطوة واحدة سريعة

على أساس مبدأ إعادة التركيب ، سلس تكنولوجيا الاستنساخ ، مثل الجيل الجديد من أسلوب الاستنساخ ، لا تعتمد على عملية معقدة من انزيم الهضم ، وربط ، لا تحتاج إلى عملية متساوية من محطة الملحق ، وفقا لإعادة التركيب من 15 ~ 25 ن مثلي تسلسل الحمض النووي شظايا نهاية خطي ناقلات ، ناقلات يمكن أن تكون مستنسخة في أي مكان في أي ناقل خطي . . . . . . .

مجموعة استنساخ خطوة واحدة سريعةواحد أو أكثر من شظايا من الحمض النووي المؤتلف يمكن أن تكتمل في رد فعل واحد ، واحد جزء من الحمض النووي المؤتلف يمكن أن تكتمل في أقرب وقت 5 دقائق ، و معدل الإيجابية أعلى من 95 في المائة . وبالإضافة إلى ذلك ، فإن العوامل المساعدة في مجموعة يمكن أن تحسن بشكل فعال معدل إيجابية الاستنساخ . نظام رد الفعل الأمثل يمكن أن يتسامح مع الشوائب في تنقية المنتجات PCR إلى حد ما . نسخة مطورة من سلس استنساخ عدة لديها أعلى معدل الإيجابية وتحسين التوافق .

الخطوات التجريبية

1 - موجز الإجراءات التجريبية

2 - إعداد خطي استنساخ ناقلات

من خلال اختيار موقع مناسب استنساخ ، خطي ناقلات يمكن أن يتحقق عن طريق انزيم الهضم أو عكس PCR التضخيم .

الأنزيمية إعداد

بعض endonucleases التقييدية لا يمكن هضم الحمض النووي الحلزون الفائق بكفاءة ، وبالتالي قد ترك كميات مختلفة من الحمض النووي غير المشقوق ناقلات ، والحد من معدل الإيجابية . من المستحسن استخدام lightningtm الوجبات endonucleases ( واحد أو مزدوج endonucleases ) خطي ناقلات للحد من خلفية التحول ( إيجابية كاذبة استنساخ التي تم الحصول عليها من غير قطع ناقلات التحول ) .

ملاحظة 1 : لا dephosphorylation مطلوب خطي الناقل عن طريق انزيم الهضم .

ملاحظة 2 : بعد الانتهاء من عملية الهضم ، يقترح تعطيل endonuclease أو تنقية المنتج المستهدف من أجل إعادة التركيب .

إعداد عكس PCR التضخيم

من أجل الحد من إدخال الطفرات التضخيم ، عالية الدقة PCR ميكس هو الموصى به . prelinear البلازميد هو الموصى به للحد من تأثير على استنساخ إيجابية معدل .

ملاحظة 1 : عندما يكون هناك أي غير محددة النطاقات في المنتج PCR ، فمن المستحسن استخدام قالب eliminator ( eg21203 ) هضم البلازميد المؤتلف . وعلى العكس من ذلك ، اقترح استخدام المنتج PCR بعد تنقية .

ملاحظة 2 : عندما multifragment الاستنساخ ، فمن المستحسن أن يتم استخدام المنتج PCR بعد تنقيته .

3 - إدراج جزء من تصميم الاشعال الاسترداد

5 ' نهاية PCR التمهيدي يجب أن تحتوي على 15 ~ 25 ن ( 18 ن ) تسلسل متشابه مع نهاية المتاخمة جزء ( إدراج جزء أو الناقل ) . إذا كان الناقل هو لزج و 3 ' نهاية جاحظ ، التمهيدي يجب أن تحتوي على تصميم جاحظ . إذا كان 5 ' نهاية جاحظ ، التمهيدي تصميم يمكن أن تحتوي على جاحظ أو لا .

إدراج جزء التمهيدي التضخيم إلى الأمام :

5 ' المنبع محطة ناقلات مثلي + موقع إنزيم الهضم ( اختياري ) + جين محدد إلى الأمام تضخيم تسلسل 3 '

إدراج جزء عكس التضخيم التمهيدي :

3 ' جين محددة عكس التضخيم تسلسل + موقع إنزيم الهضم ( اختياري ) + 5 ' محطة ناقلات مثلي المصب

ملاحظة 1 : عندما ع المحتوى في المنطقة من 25 NT المنبع والمصب من ناقلات استنساخ الموقع هو 40 ٪ ~ 60 ٪ ، إعادة التركيب عالية .

ملاحظة 2 : تسلسل puc-19 الناقل ( أمبير ) في هذه المجموعة هي كما يلي :

4 - PCR التضخيم من إدراج جزء

عالية الدقة PCR ميكس هو الموصى به للحد من إدخال التضخيم الطفرات . من المستحسن أن نقاء المنتج PCR يمكن استخدامها مباشرة إذا كان المنتج PCR تم تحديدها من قبل الاغاروز الكهربائي الهلامي ، ولكن حجم العينة لا ينبغي أن تتجاوز 20 ٪ من مجموع حجم التفاعل .

5 - إعادة التركيب

① رد فعل النظام التالي في حمام الماء المثلج :

أ - الناقل الأمثل جرعة ( نانوغرام ) = 0.02 × الناقل قاعدة اللوغاريتم ، أو 0.03 pmol . . . . . . .

ب - إدراج جزء واحد ، الجزء الأمثل جرعة ( نانوغرام ) = 0.04 × جزء قاعدة اللوغاريتم . إدراج شرائح متعددة ، وتطبيق كمية ( نانوغرام ) = 0.02 × قاعدة لوغاريتمي لكل جزء .

ملاحظة 1 : إذا كان طول إدراج جزء واحد هو أكبر من ذلك من الناقل ، الناقل إدراج جزء ينبغي تبادلها .

ملاحظة 2 : إذا كان طول إدراج جزء أقل من 200 بي بي ، ثم إدراج جزء ينبغي أن تستخدم 5 مرات كمية الناقل .

ملاحظة 3 : إذا كان المبلغ المحسوب وفقا للصيغة أعلاه يتجاوز/ أعلى قيمة ، ثم اقترح مباشرة عن طريق الضغط علىزوياستخدام / الحد الأقصى للاستهلاك؛

ملاحظة 4 : ناقلات جزء طويل جدا ، إدراج جزء طويل جدا أو عدد كبير جدا من شظايا ، استنساخ معدل الإيجابية سوف تنخفض .

بعد الانتهاء من إعداد رد فعل النظام ، ماصة بندقية تستخدم لامتصاص الخليط بلطف لتجنب توليد فقاعات الهواء ، لا دوامة .

② وضع رد فعل النظام في 50 ℃ لمدة 5 ~ 60 دقيقة .

ملاحظة 1 : من المستحسن استخدام PCR وغيرها من أدوات التحكم في درجة الحرارة أكثر دقة من رد الفعل ، وعدم كفاية وقت رد الفعل أو طويلة جدا كفاءة الاستنساخ سوف تنخفض .

ملاحظة 2 : وقت رد الفعل الموصى به هو 5 ~ 15 دقيقة عند إدراج 1 ~ 2 أجزاء . وقت رد الفعل الموصى بها من 15 إلى 30 دقيقة عند إدراج 3 إلى 5 أجزاء .

ملاحظة 3 : عندما يكون الناقل هيكل عظمي أكثر من 10 كيلوبايت أو إدراج جزء أكثر من 4 كيلوبايت ، فمن المستحسن أن يطيل وقت رد الفعل إلى 30 ~ 60 دقيقة .

بعد الانتهاء من رد الفعل في 4 : 50 ℃ لحظية الطرد المركزي هو الموصى به .

③ وضع رد فعل السائل أنبوب الطرد المركزي على الجليد لتبريد ، ثم تحويل أو تخزين في - 20 ℃ . . . . . . .

ملاحظة 1 : recombinants المخزنة في درجة حرارة تتراوح بين 20 ℃ ينبغي أن تستخدم في غضون أسبوع واحد .

6 - تحويل المنتجات المؤتلف

أخذ 5 ~ 10 μ ل رد فعل السائل ، إضافة إلى 100 μ ل الخلايا المستشعرة ، امتص ببطء ، مختلطة ، وضعت على الجليد لمدة 30 دقيقة . صدمة الحرارة 45 ~ 60 ثانية في 42 ℃ والجليد حمام لمدة 5 دقائق . إضافة 500 ميكرولتر من شركة نفط الجنوب أو رطل متوسطة الثقافة في 37 ℃ لمدة 40 ~ 60 دقيقة ( 200 دورة في الدقيقة ) . البكتيريا السائل بالتساوي المغلفة على لوحة مسطحة تحتوي على المضادات الحيوية المقابلة ، مقلوب في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها الثقافة .

ملاحظة 1 : معدل الإيجابية في نهاية المطاف استنساخ مختلف الخلايا المستشعرة مختلفة . كفاءة التحويل > 108 كفو / ميكروغرام من الخلايا المستشعرة الموصى بها .

ملاحظة 2 : مستعمرة عدد يعتمد على كمية نقاء المنتج PCR و خطي الناقل .

ملاحظة 3 : عدد كبير من المستعمرات البيضاء عادة ما تنمو في لوحة التحكم إيجابية ، في حين أن عدد قليل جدا من المستعمرات تنمو في السلبية لوحة التحكم .

7 . إيجابية اختبار الاستنساخ

مستعمرة واحدة كانت مختلطة في 10 μ ل ddh2o لمدة 10 دقائق في 95 ℃ ثم 1 μ ل ليزات كان يستخدم كقالب لتحديد مستعمرة PCR ، أو مستعمرة واحدة تم تلقيح في مقاومة متوسطة الثقافة بين عشية وضحاها ، ثم تم استخراج البلازميد انزيم الهضم .

مستعمرة بكر الاشعال كانت تستخدم الاشعال العالمي m13f و m13r ، هند الثالث و ecori كانت تستخدم لتحديد انزيم الهضم .

ملاحظة 1 : واحد على الأقل من التمهيدي العالمي المقترح في مستعمرة بكر لتجنب نتائج إيجابية كاذبة .

ملاحظة 2 : إذا لزم الأمر ، فإن النتائج الإيجابية يمكن أن تكون متسلسلة .

注3： M13F: TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R: CAGGAAACAGCTATGAC

Azaood ، التي تأسست في عام 2004 ، هو تطوير وتصنيع عالية الجودة تنقية الانزيمات والبروتينات والأحماض النووية ، ومجموعات عزل الخلايا ، مصل بقري جنيني ( FBS ) المستخدمة في بحوث علوم الحياة ، والتشخيص ، وتطبيقات التكنولوجيا الحيوية . Azood الشركة هي الشركة المصنعة الرئيسية مع شهادة ISO9001 ، والتي يمكن أن تلبي متطلبات الشركة من البحوث على نطاق واسع دفعة المعالجة البيولوجية وتصنيع المعدات الأصلية التطبيقات .