السلع الجافة : تفسير دليل misev2023
التاريخ:2024-09-26اقرأ:1
أحدث misev الذي طال انتظاره قد حان أخيرا ! حويصلة خارج الخلية ( إف ) قد جذبت اهتماما واسعا منذ اكتشافها ، وعدد من البحوث العلمية ذات الصلة قد ازداد باطراد سنة بعد سنة . وقد أحرز تقدم كبير في فهم وتطبيق إف . ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض العقبات في تحقيق إف من علم الأحياء الأساسي إلى التطبيق السريري بسبب التحدي المتمثل في تسمية إف ، وفصل غير حويصلي جزيئات خارج الخلية ، وتوصيف وظيفة إف .من أجل التعامل مع التحديات والفرص في هذا المجال من التطور السريع ، المجتمع الدولي من الحويصلات خارج الخلية ( ISEV ) تحديث الحد الأدنى من المعلومات دليل ( misev ) عن الحويصلات خارج الخلية البحث ، الذي صدر لأول مرة في عام 2014 ( misev2014 ) ، واستكمال طبعة واحدة في عام 2018 ( misev2018 ) ، واقترح بعض الطرق التجريبية لوصف إف ، على أساس أكثر تعمقا و تقييم نقدي في عام 2014 . على الرغم من أن هناك بعض التأخير بسبب " قناع " الحدث ، الأصلي أربع سنوات صناعة الكتاب المقدس لا يزال يخرج في وقت متأخر من السنة ، مشيرا إلى اتجاه جديد في مجال إف . . . . . . .أحدث misev2023 نشرت لأول مرة في شكل ورقة موقفنعمفي هذه الورقة ، فإننا نقدم أحدث التوصيات بشأن الأساليب المتاحة للباحثين و مزاياها وعيوبها في إنتاج وفصل وتوصيف إف من مصادر مختلفة . بالإضافة إلى إدخال التكنولوجيا الجديدة في دراسة المبادئ الأساسية إف ، فإنه يشمل أيضا أحدث التقنيات والأساليب في هذا المجال . و دعونا نرى :
تقدير عدد إف ، تحديد وجود إف ، وتقييم تأثير غير إف إف المكونات في إعداد إف ، الخ . توصيف إف يواجه تحديات مثل حجم الجسيمات الصغيرة ، وحجم التباين و التباين الجزيئي ، وعدم وجود العام إف الاعتراف غير إف خصوصية العديد من تقنيات القياس .أي قياس أو طريقة يمكن أن تلبي جميع متطلبات EV توصيف ، لذلك فمن المستحسن أن يتم التحقق من بعضها البعض باستخدام أسلوب متعامدوهذا يعني أن اثنين أو أكثر من أساليب مختلفة من حيث المبدأ الموصى بها للكشف عن نفس المؤشر .
التكوين العام إف ( البروتين ، الدهون ، الأحماض النووية ، وغيرها من الجزيئات البيولوجية ، الخ . ) على الرغم من أن هذه القياسات الجزيئية الفردية يمكن استخدامها لتقدير إف وفرة ، هذه القيم ليست بالضرورة ذات الصلة إلى تركيز إف تماما ، وليس هناك عالمية بين المواد المصدر . لذاأنها لا تستخدم لقياس تركيز إف . . . . . . .كما لا يوجد جزيء واحد يمكن الكشف عن كمية كل إف ، لا توجد علامات عامة أو إف إف فرعي . علامات محددة يجب أن تكون مختارة على أساس أدلة على خصوصية المصدر ونوع . في الوقت الحاضرلا توجد علامات عامة معروفة لتحديد جميع إف ، بغض النظر عن مصدرها .في ما يسمى exosomes ، عالمية هذه العلامات ليست واضحة أو مقبولة . يرجى ملاحظة أن تقارب القائم على المخططات التي تنطوي على quadrimembrane البروتينات CD9 cd63 , و cd81 ليست محددة exosomes EV فرعي . EV السكان المخصب مع الأجسام المضادة ضد واحد من هذه البروتينات لا يمكن أن تغطي جميع المكونات الجزيئية . وعلاوة على ذلك ، ليس كل EVS عن هذه العلامات ، حتى أربعة عبر الغشاء التخصيب لا يمكن التقاط جميع EVS .متعامد طريقة للكشف عن نفس بارامترات مميزة( أكثر من طريقة مبدأ واحد )من غير المرجح أن يكون نفس الانحراف . على سبيل المثال ، أقطار إف مستمدة و الكشف عن كل من الأساليب البصرية وغير البصرية الأساليب .من المهم أيضا أن تثبت أن coseparate مستقلة عن المؤشرات الحيوية أو اكتشاف وظيفة .لأن العديد من أساليب توصيف EV ليست مناسبة خاصة إف ، أو لا يمكن الكشف عن جميع إف ، من الضروري نشر الأساليب والنتائج بشفافية لضمان تكرار إف البيانات .
قياس حجم وكمية إف يحدد عدد التركيز ( في أجزاء / مل ) ، وهو مؤشر على نطاق واسع . ومع ذلك ، فإنه عادة ما تكون غير موثوق بها لأن العديد من التقنيات تفتقر إلى خصوصية إف وحساسية لجميع إف .الفريق العامل المعني بصرامة وتوحيد المواد المرجعية EV ISEV مؤخرا لمحة عامة عن اعتبارات تكنولوجيا القياس ، والتحديات التي تواجه هذا المجال في قياس التتبع ، وتطوير وتقديم تقارير عن وصف جيد EV المواد المرجعية . واحدة من النقاط المضيئة الرئيسية في هذا العمل هو الحاجة إلى الكشف عن اللد ، مما يسمح للآخرين للتحقق من النتائج ، بغض النظر عن حساسية القيود .موثوقية قياس تركيز إف يمكن تحسينها من خلال استخدام أسلوب متعامد . . . . . . .，كل طريقة محددة اللد ، مثل الكشف عن شدة الضوء المتناثرة( مثل NTA )كثافة مضان( مثل FCM )الحجم المادي( مثل RPS ) ،لأن أسلوب متعامد لا نفس قياس الحدعلى سبيل المثال ، المقاومة نبض التعريفي ( RPS ) تقنية يمكن استخدامها لتمثيل اللد مع حجم الجسيمات . عن التقنيات البصرية مثل قياس التدفق الخلوي ، اللد يمكن الإبلاغ عنها من قبل قطر المستمدة من تشتت الضوء البصرية نموذج أو ما يعادلها من كثافة مضان مضان للذوبان مجموعة ( mesf ) الجزيئات . هذه الأساليب يمكن أن تولد بيانات متسقة بين مختلف الصكوك والحساسيات . لأن هناك العديد من المتغيرات في الكشف عن الجسيماتفي الوقت الحاضر ، لا توجد طرق تتبع وتحليل ( NTA ) ، تشتت الضوء الديناميكي ( DLS )وتتبع اللد من التدفق الخلويمنتدىوفيما يتعلق بالتكنولوجيات التي لا يمكن فيها التمييز بين إف وغيره من المواد أو الملوثات التي يمكن فصلها بصورة مشتركة ، يُقترح الإبلاغ عن التركيزات بأنها " تركيزات الجسيمات أو تركيزات الجيش الشعبي " بدلاً من " تركيزات إف " بصرف النظر عن الخطوات السابقة للانفصال .
قياس حجم إف ( نانومتر قطرها أو القطر ) يعتمد على افتراضات مثل كروية أو التنقل ، والناتج قد تتأثر المتغيرات المنبع . تدفق عالية الأساليب الشائعة ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي NTA、RPS、 كل زاوية تشتت الضوء ودينامية تشتت الضوء ( DLS ) يفترض إف كروية . على الرغم من أن " حجم " و " قطر " غالبا ما تستخدم في التواصل بين أساليب القياس ، الاشتقاق قد يؤدي أيضا إلى اختلافات متسقة بين تقنيات القياس . على سبيل المثالتقنية تعتمد على الحركة البراونية من الجسيمات ( مثل NTA أو DLS ) يقيس قطرها الهيدروديناميكية ، مما يؤدي إلى المبالغة في تقدير حجم الجسيمات بالمقارنة مع أساليب التصوير مثل تجميد المجهر الإلكتروني .هناك عدد قليل جدا من الطرق التي يمكن قياس حجم إف بدقة في جميع أنحاء القطر ممكن مجموعة من عشرات نانومتر ميكرون . على سبيل المثال ، على الرغم من أن التصوير عالية الدقة من تجميد المجهر الإلكتروني هي واحدة من أكثر الطرق دقة ، كشف تدفق منخفض نسبيا ، والعديد من أكبر إف تميل إلى أن تكون صغيرة و قد لا تكون قابلة للقياس الكمي . القدرة على قياس التباين المنخفض إف أقل من 100 نانومتر قد يكون أيضا عاملا مقيدا .
كما المزيد والمزيد من الباحثين استخدام تقنية تحليل الجسيمات واحدة خاصة مع حساسية أعلى ، أصبح من الواضح أن العديد من تركيبات EV تظهر غير صحيح انحراف التوزيع ، على سبيل المثال ، lognormal التوزيع ، حيث معظم EV قطرها أقل من 100 نانومتر .وينبغي أن يشارك الباحثون في الكشف عن توزيع القطر إف，ليس فقط متوسط الحجم ، حجم التركيز ، أو متوسط الحجم الكليهذه المؤشرات تميل بسهولة بسبب اللد وعدم تناسق حجم التوزيع . يرجى ملاحظة أنتركيب حجم البيانات الإحصائية ، على سبيل المثال ، من خلال قياس انخفاض مؤشر الانكسار الجسيمات NTA ، قد تكون أقرب إلى اللد من الصك من الوضع الحقيقي قطرها إف السكان .تقنيات تحديد حجم الجسيمات باستخدام البرمجيات مع خوارزميات الملكية يمكن أن يؤدي أيضا إلى الاختلافات بين إصدارات البرمجيات أو منصات البرمجيات ، وبالتالي ينبغي أن تكون البرامج المقدمة .حجم التكنولوجيا المستمدة من افتراض الانكسار قد تختلف بسبب اختلاف مكونات العينة وتحميل المواد .حجم المستمدة من تحقيقات الفلورسنت ( على سبيل المثال ، جزءا لا يتجزأ من الأصباغ في الغشاء ) قد تختلف بسبب إدراج الأصباغ المختلفة على أساس مختلف غشاء الدهون المكونات . وفيما يتعلق بالتكنولوجيات التي لا يمكن فيها التمييز بين مركبات الكربون الكلورية فلورية ومركبات الكربون الكلورية فلورية / الملوثات ، يُقترح أن يُعرَف تقرير القطر بأنه " جسيم " أو " EP " بدلاً من " EV Diam " بصرف النظر عن الخطوات السابقة للانفصال .
ثالثاً - المسائل التي تحتاج إلى اهتمام في تقرير خاص عن EV توصيف التكنولوجيا
جنبا إلى جنب مع استخدام EV اختبار أداة ، وتوسيع نطاق المعرفة من الخبراء ، وتحديد نطاق التمثيل ذات الصلة تقرير يتزايد باستمرار ، من أجل ضمان موثوقية البيانات وتكرارها . إن misev2023 المبادئ التوجيهية قائمة مفصلة من الاحتياطات من أجل الحد الأدنى من التجارب و تقارير محددة عن الصك . هذه عادة ما تكون مناسبة بغض النظر عن التصميم التجريبي . التقنيات المذكورة هنا ليست شاملة ، والعديد من تقنيات الكشف التي يجري تطويرها أو يجري بحثها بنشاط . ومع ذلك ، فإن التكنولوجيات المذكورة متاحة تجاريا ، وقد نشرت من قبل العديد من الباحثين . بسبب القيود المفروضة على حجم الجسيمات ، ونحن هنا فقط قائمة بعض الأدوات التي تستخدم عادة لوصف حجم الجسيمات وتركيز إف و وجهات النظر الرئيسية .قياس التدفق الخلوي ، التدفق الخلويISEV توصي بأن السيطرة على المجموعة ينبغي أن تشمل homotypic الأجسام المضادة للكشف عن الأجسام المضادة ، أو homotypically يقترن القبض على الخرز ، الخرز تحتوي فقط على الكشف عن الأجسام المضادة ( القبض على الخرز المغلفة مع الأجسام المضادة ) ؛ معايرة إشارة ينبغي أن تظهر مع التركيز على عدة عينات من إف . إذا كانت الخرز مستعدون ، والكواشف الكيميائية وتكوينها ينبغي نشرها . وينبغي أيضا نشر كتالوجات وأرقام الدفعات الخاصة بالكشف التجاري عن الخرز الصغير؛ متوسط كثافة مضان من الخرز موحدة تم الكشف عنها . البيانات والإحصاءات من متوسط كثافة مضان من جزيئات قابلة للذوبان ( ما يعادل mesf ) التي تم الحصول عليها من monomorphic الخرز تم الكشف عنها . منهجية كاملة ومفصلة ينبغي نشرها .في عام 2023 ، بناء على مبادرة من المجتمع الدولي extracellular الحويصلات ( ISEV ) ، الجمعية الدولية لتقدم تعداد الخلايا ، الجمعية الدولية thromboembolization والتجلط ( EV flowcytometry الفريق العامل ) ، مخطط واحد إف flowcytometry تم نشرها ، والتي يمكن أن تحل المشاكل التي تحتاج إلى الاهتمام في تطوير واحد إف flowcytometry . . . . . . .معايرة حجم العينة ، مضان وتشتت الضوء المعلمات أمر بالغ الأهمية من أجل تفسير وتكرار واحد إف تدفق النتائج . إذا كنت الإبلاغ عن تركيز الجسيمات باستخدام واحد إف التدفق الخلوي ، تحديد الحد الأعلى والحد الأدنى من اللد للسماح متعامدة أو طريقة أخرى لتكرار والتحقق من النتائج .في الوقت الحاضر ، التصوير الخلوي يستخدم طريقة تحريك دينامية ، مما يجعل من الصعب تحديد أقل اللد ، وبالتالي من الصعب توحيد .DLS， المعروف أيضا باسم ارتباط الفوتون الطيفي ( PCS ) و ( quasiclastic تشتت الضوء qels ) هي تقنية قادرة على تحديد قطر الهيدروديناميكية كافية مونوديسبيرسي الجسيمات في محلول مائي مخفف التشتت . دالة الارتباط الذاتي DLS يقيس كثافة الليزر المنبعثة من جزيئات متعددة في الحل . دالة الارتباط الذاتي يحمل معلومات عن معامل انتشار الجسيمات التي ترتبط مع قطر الهيدروديناميكية من خلال ستوكس اينشتاين الحركة البراونية النظرية .العديد من الخوارزميات التي يمكن استخدامها للحصول على معامل انتشار من قياس تناسب ذاتي وظيفة . الأسلوب الأكثر شيوعا هو تحليل متراكمة ، ولكنويفترض أن جميع العينات هي مونوديسبيرسي حجم التوزيع ، في حين أن EV عينات لا تملك هذا النوع من التوزيع .بالنسبة polydisperse توزيع حجم العينة ، معامل التوزيع من نشر وظيفة تناسب ذاتي هو سوء مشكلة رياضية . هذا يعنيدلس لا ينبغي أن تستخدم لتحديد الخصائص الكمية EV عيناتما لم يتم تطبيق دلس على جزء من إف مع مونوديسبيرسي الحجم . من ناحية أخرى ، DLS يمكن استخدامها لتحديد نوعية وجود جزيئات submicron وربما المجاميع في إف عينات .مختلف المجهر الإلكتروني ( م ) هي واحدة من عدد قليل من التقنيات التي يمكن الكشف عن إف ، بغض النظر عن حجمها . ومع ذلك ، فإن تدفق المجهر الإلكتروني يعني أيضا أن أكبر EVs إحصائيا أقل من أصغر EVs . ووزارة شؤون المرأة ، تيم و cryo-em كلها عالية الدقة EV توصيف الأساليب ، وأنها لا تحتاج إلى التبديل بين بعضها البعض أو يمكن أن توفر نوعية مماثلة من الصور . على سبيل المثالcryo-em يمكن أن تظهر بوضوح هيكل بلير الدهن ، والحفاظ على شكل إف أفضل من تيم الجفاف حالة ثابتة عينة ، وربما أكثر دقة تحديد الكمية ( الحجم ) ،لأن جميع الجزيئات في حجم معين يمكن تصويرها ، وليس فقط تلك التي تعلق على سطح الشبكة .دراسة عن توحيد م طريقة لتحديد انخفاض متطلبات الإبلاغ محدودة جدا . عن تيم ، ثلاث معلمات رئيسية ينبغي نشرها : التثبيت ، والامتزاز ، سلبية تلطيخ . التثبيت يشمل استخدام المثبتات وتركيز الحضانة مرة . الامتزاز يتكون من شبكة الناقل المواد ، شبكة الناقل الحجم ، نوع الفيلم ، والطلاء ، الحضانة الوقت وتنظيف التفاصيل . تفاصيل سلبية تلطيخ ينبغي أن تشمل الركيزة ، والتركيز ، الحضانة مرة . وعلاوة على ذلك ، ينبغي نشر معايير اختيار انخفاض وارتفاع معدل الصور والصور .تتبع وتحليل الجسيمات النانويةNTA， ويعتقد أيضا أن تتبع الجسيمات واحدة هي تقنية بصرية تستخدم على نطاق واسع في تقدير حجم الجسيمات وتركيز إف الميدان . في كثير من الأحيان ، NTA يستخدم خوارزمية للحد من الاختلاف في توزيع القطر للحصول على الهيدروديناميكية القطر من خلال قياس معامل انتشار الجسيمات . ومن الجدير بالذكر أنFTLA الخوارزميات المستخدمة في بعض أجهزة NTA وضعت لتمثيل أفضل مونوديسبيرسي المخاليط ، في حين أن إف لا ، والتي يمكن أن تؤدي إلىوعلاوة على ذلك ، لا توجد حاليا طريقة لتحديد أو نشر اللد NTA الإعدادات . وقد أجرى العديد من العلماء عدة دراسات موحدة لمقارنة النتائج بين المستخدمين والأجهزة .استخدام NTA لقياس توزيع القطر وتركيز السوائل البيولوجية المعقدة ينبغي أن تفسر بحذرلأنه يحسب coinsections مثل البروتينات الدهنية والبروتينات الكبيرة المجمعات .NTA لا يمكن تحديد إف أكثر من بضع مئات من نانومتر في القطر .منتدىمعلومات عن NTA ، بما في ذلك نوع الصك ، نوع الكاميرا ، إعدادات الكاميرا ، ليزر الطول الموجي ، قوة الليزر ، نسخة البرنامج ، إعدادات التحليل و الجسيمات في كل إطار . إذا كان يعرفخوارزمية لتوليد توزيع القطر ينبغي نشرها ، لأن النتائج قد تختلف اعتمادا على الخوارزمية المستخدمة .في حالة تشتت الضوء أو الكشف عن مضان واسطة ، فمن المستحسن استخدام العازلة فارغة مثل السيطرة . أما بالنسبة فلوري NTA ، مجموع عدد الجسيمات في تشتت الضوء وطريقة وصفها عدد الجسيمات في وضع فلوري ، وصفت طريقة إزالة العازلة / كاشف السيطرة عنها لتقييم pseudocolor المسمى .إذا كان السائل جهاز أخذ العينات المستخدمة ، وينبغي أيضا أن تكون مجموعة نشرتمنتدىهذه هي المرة الأولى التي misev يستخدم المقاومة المستحثة النبضات ( RPS ) تقنية لوصف EV الجسيمات جنبا إلى جنب مع تدفق المستندة إلى أساليب ( بما في ذلك تدفق المستندة إلى الخرز واحد إف تدفق المستندة إلى الأساليب ) و ( بما في ذلك مجهر القوة الذرية ، المجهر الإلكتروني ، DLS ، NTA ، فائقة الدقة المجهر ، وما إلى ذلك ) . كما أنها واحدة من عدد قليل من التقنيات البصرية EV توصيف المبادئ .RPS يستخدم مبدأ كورت لتحديد تركيز الجسيمات وقطرها ، وبعض الأجهزة لديها أيضا زيتا المحتملة وظيفة . في الوقت الحاضر ، قطرها اللد RPS هو أقل من نحو 50 نانومتر .RPSنتائج القياستيمالبيانات عالية جدا من الاتساق .عند الإبلاغ عن بيانات RPS ، فمن المستحسن أن تنشر نوع الصك ، الفتحة ، معايرة حبة القطر و المصدر و نسخة من البرنامج . وكما ذكر سابقا ( حجم الجسيمات الكمي ) ، بالنسبة للبيانات إف ،فمن المستحسن أن يتم نشر إحصاءات عن توزيع القطر RPS بدلا من قطر واحد . واقترح أن تدرج في المقابل فارغة عازلة لتحديد الخلفية .و نفس تركيز المنظفات بعد تكسير العينة لتحديد علامة الحدث . لأن RPS التكنولوجيا يمكن بسهولة أن تكون مسدودة من قبل أكبر الجسيمات ، يمكن استخدام الطرد المركزي أو الترشيح وغيرها من الخطوات التحليلية لإزالة أكبر الجسيمات . وبما أن هذه الأساليب يمكن أن تغير السكان EV التي يجري تحليلها و تؤثر على المقارنة مع أساليب متعامد ، أي تحليل ما قبل المعالجة ينبغي أن تكون محددة بوضوح .معلومات مفصلة عن تخصيب البروتين والكمية المطلوبة . إذا كان ذلك ممكنا ، ينبغي أن تشمل الضوابط الإيجابية والسلبية المستضدات . إذا كان البروتين هو ادعى أن تكون ذات صلة إف ، النقاء قياس إف الإعداد يجب أن تدرج . جميع التفاصيل ( بما في ذلك ولكن لا تقتصر على معلومات عن الأجسام المضادة ، عينة التشويه والتحريف والحد من الظروف ، طريقة التحويل ، نوع الغشاء ، العازلة ، ومعدات التصوير و المعلمات ) عن توحيد العينات ، الاستشراب هلام ، غشاء طريقة التحويل ، والتحقيق ، والتصوير والتحليل . يوفر جميع الصور غير قلص البنك الدولي ( إذا نشرت في المجلات ، تحتاج إلى معلومات إضافية ) .في كل فصل من هذه المبادئ التوجيهية ، طرق مختلفة لوصف إف تناقش على التوالي ، مع اقتراحات محددة . وبغض النظر عن النهج المتبع ، يرد أدناه ملخص للتوصيات العامة التي تم تحديدها :
- كل إف الإعداد يجب أن تكون محددة من خلال القياسات الكمية من مصدر إف ( على سبيل المثال ، عدد الخلايا الإفرازية ، حجم السوائل البيولوجية ، ونوعية الأنسجة ، الخ . )
- وينبغي تقدير وفرة إف ( بما في ذلك عدد الجسيمات والبروتين و / أو محتوى الدهون ) .
- إذا كان هناك أي من المكونات ذات الصلة إلى سلالة إف إف إف أو ينبغي الكشف عنها ، اعتمادا على خصوصية الهدف من التجربة .
- تحديد وجود درجة غير حويصلي وشارك في فصل المكونات .
- عند استخدام المؤشرات الكمية لوصف إف ، الحد من الكشف ( اللد ) من الصك أو الأسلوب المطلوب .