pc-12 تمايز الخلايا في الفئران ورم القواتم الكظرية

قابلة للتفاوضتحديث05/06

نموذج

طبيعة المصنع: المنتجين

فئة المنتج

مكان المنشأ

استشارة عبر الإنترنت

نظرة عامة

الهدف من دراسة تأثير pc-12 تمايز الخلايا في الفئران ورم القواتم الكظرية ( adrenocytomas pc-12 ) .

تفاصيل المنتج

pc-12 تمايز الخلايا في الفئران ورم القواتم الكظرية

pc-12 تمايز الخلايا في الفئران ورم القواتم الكظريةهو خط خلية النمو المستمدة من الفئران adrenomedullopheochromocytomas ، والتي يمكن أن تفرق في الخلايا العصبية في إطار العمل من عوامل محددة ، مع الحفاظ على وظيفة إفراز الناقل العصبي ، يصبح النموذج الكلاسيكي في المختبر لدراسة التنمية العصبية ، الإشارات العصبية و العصبية إصلاح الضرر ، ويوفر مفتاح التجريبية ناقلات البحوث الأساسية في علم الأعصاب و التحول السريري من الأمراض العصبية .

الخصائص البيولوجية الأساسية

( أ ) العلاقة بين المصدر ونوع الخلية

إن خلايا ورم القواتم معزولة من نخاع الغدة الكظرية من الفئران ، والتي لديها القدرة على توليف وإفراز الكاتيكولامينات الناقلات العصبية ( على سبيل المثال ، norshen الأدينوساين ، الدوبامين ) و هي مماثلة لتلك التي من خلايا الغدد الصم العصبية في الجهاز العصبي الودي . إن pc-12 الخلايا أظهرت epithelioid التشكل في حالة غير متمايزة ، والتي لديها القدرة على التكاثر غير محدود من الخلايا السرطانية و الخصائص الأساسية من خلايا الغدد الصم العصبية . ومع ذلك ، فإنه يمكن أن تفرق في الخلايا العصبية مثل شكل نورایت ، والتي لديها بعض هيكل وظيفة من وظائف الخلايا العصبية .

مورفولوجيا وتمايز الخصائص

في حالة غير متمايزة ، الخلايا كانت مضلعة أو بيضاوية الشكل ، في حين أن الخلايا الملتصقة الجدار نمت بشكل كثيف ، الاتصال بين الخلايا كانت قريبة ، السيتوبلازم يحتوي على عدد قليل من حبيبات القاعدية ( الناقل العصبي حبيبات التخزين ) ، نواة مستديرة ، نويات واضحة ، لونين توزيع موحد ، وتكاثر الخلايا قدرة قوية ، مضاعفة الوقت حوالي 48-72 ساعة .

بعد تمايز الخلايا ، مورفولوجيا الخلايا تغيرت بشكل ملحوظ : في إطار العمل من عامل نمو الأعصاب ( NGF ) وغيرها من العوامل ، استطال نورایت ( طول يصل إلى 5-10 مرات من قطر الخلية ) بدأت تظهر في غضون 24-48 ساعة . وفي الوقت نفسه ، العصبية علامات محددة ( على سبيل المثال ، neurofilament nf-200 و map2 ميكروتوبولي البروتين ذات الصلة ) عن بعض pheochromocytomas ( على سبيل المثال ، إفراز الكاتيكولامينات ) لا تزال تحتفظ بعض الخصائص الخلوية ( على سبيل المثال ، إفراز الكاتيكولامينات ) .

الخصائص الجزيئية والوظيفية

على المستوى الجزيئي ، pc-12 الخلايا العصبية ذات الخصائص الجزيئية الأساسية : التعبير عن مستقبلات عامل نمو الأعصاب ( تركا ، p75ntr ) في حالة غير متمايزة ، وتوفير الأساس الجزيئي للحث على التمايز . بعد التمايز ، والتعبير عن الجينات الرئيسية ( التيروزين هيدروكسيلاز ال الدوبامين β - هيدروكسيلاز DBH ) في مسار التوليف العصبي بشكل ملحوظ upregulated ، إفراز الغدة الدوبامين في norshen زيادة 3-5 مرات مقارنة مع undifferentiated الدولة . وفي الوقت نفسه ، تنبيغ الإشارة العصبية المرتبطة البروتينات ( على سبيل المثال ، synapsin SV2 و synapsin أنا ) upregulated ، والتي لديها القدرة على تشكيل هياكل متشابك ، ويمكن محاكاة الإشارات العصبية .

من الناحية الفنية ، تمايز الخلايا pc-12 حساسة العصبية ( مثل 6-hydroxydopamine اميلويد بيتا ) ، والتي يمكن أن تؤدي إلى انكماش الخلايا العصبية و الخلايا العصبية بعد التعرض .

في المختبر والثقافة والتمايز

( أ ) شروط التدريب الأساسية

يفضل اختيار وسائل الإعلام الأساسيةاستخدامrpmi-1640 متوسطةإضافة 10 ٪ مصل الحصان ، 5 ٪ مصل بقري جنيني ( مزيج من اثنين من المصل يمكن الحفاظ على انتشار الخلايا غير متمايزة الدولة ) و 1 ٪ المضادة للبكتيريا وكيل ( منع التلوث الجرثومي ) . الثقافة يجب أن تكون البيئة بدقة الحفاظ على 37 ℃ ، 5 ٪ CO ̀ ، 95 ٪ الرطوبة ، تركيز CO ̀ تقلب لا يتجاوز ± 0.5 في المائة ، ودرجة الحموضة 7.2-7.4 ، الضغط الاسموزي 280-320mosm / كغ . درجة حرارة عالية جدا ( > 39 ℃ ) يمكن أن يؤدي إلى زيادة معدل موت الخلايا المبرمج ، في الوقت الحقيقي رصد البارامترات البيئية من خلال حاضنة الاستشعار .

عملية التمايز المستحث

العوامل التي يسببهاعامل نمو الأعصاب ( NGF )، خطوات محددة على النحو التالي :

عندما تصل إلى 60 ٪ - 70 ٪ تقارب الخلايا ، متوسطة تحتوي على 50 نانوغرام / مل من نجف ( rpmi-1640 + 1 ٪ حصان + 1 ٪ مصل بقري جنيني ) تم استبداله .

كل 2-3 أيام ، وسائل الإعلام يمكن أن تتغير للحفاظ على تركيز ثابت من نجف .

بعد 5-7 أيام من الثقافة ، مورفولوجيا نورایت لوحظ تحت المجهر ( نسبة إيجابية نورایت الخلايا أكثر من أو يساوي 70 في المائة ) و التعبير عن map2 و nf-200 يمكن الكشف عنها من قبل immunofluorescence . . . . . . .

وبالإضافة إلى ذلك ، وغيرها من العوامل المحفزة ( مثل الدماغ المستمدة من عامل التغذية العصبية و forskolin ) يمكن أن تستخدم أيضا ، ولكن تكرار نجف هو أفضل .

` 3 ` التجميد والإنعاش

إن rpmi-1640 متوسطة تحتوي على 10 ٪ DMSO ، 20 ٪ مصل بقري جنيني و 10 ٪ مصل الحصان كان يستخدم cryopreserved . تركيز الخلايا غير المتمايزة تم تعديلها إلى 1 × 10 - 2 × 10 خلايا / مل ( الخلايا المتمايزة من السهل أن تتلف بسبب نورایت ، لا ينصح بالتبريد ) ثم تم تخزينها في درجات حرارة مختلفة في 4 ℃ لمدة 30 دقيقة - 20 ℃ لمدة 1 ساعة - 80 ℃ . . . . . . .

عندما يتعافى ، وتجميد أنبوب يوضع بسرعة في حمام مائي في 37 ℃ لمدة 1-2 دقيقة ، ثم تضاف على الفور مع 10 مرات حجم التسخين المتوسطة الأساسية تمييع ، 1000 * ز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق لإزالة DMSO ، بعد إعادة تعليق ، تلقيح في الثقافة زجاجة ، معدل البقاء على قيد الحياة من الانتعاش عادة ما تصل إلى أكثر من 75 ٪ . بعد الإنعاش ، 2-3 أجيال من الخلايا المستزرعة ، ثم تمايز الخلايا الناجم عن التشكل مستقرة ، وبالتالي تجنب تأثير الإجهاد على كفاءة الإنعاش التمايز .

ثالثاً - سيناريوهات التطبيق التجريبي الرئيسي

دراسة عن آلية التنمية العصبية والتمايز

pc-12 الخلايا العصبية هي نموذج أساسي من تمايز الخلايا العصبية - الآلية الجزيئية التي تنظم تمايز الخلايا العصبية يمكن تحليلها من خلال الكشف عن تفعيل تركا مسارات الإشارات ( مثل PI3K / AKT ، راس / MAPK مسارات ) خلال NGF التعريفي . تدخل الجينات ( على سبيل المثال ، سيرنا بالضربة القاضية تركا الجينات ) كانت تستخدم لمراقبة neurites والتعبير عن علامات العصبية . . . . . . . وعلاوة على ذلك ، فإن آثار جينية التعديلات ( مثل الحامض النووي و أستلة هيستون ) على التعبير عن الجينات المرتبطة تمايز الخلايا العصبية ( مثل ال map2 ) يمكن دراستها .

بناء و دراسة آلية الأمراض العصبية

اعتمادا على حساسية الخلايا العصبية بعد التمايز ، نماذج مختلفة من الأمراض العصبية في المختبر يمكن بناؤها .

مرض باركنسون ( المشتريات ) نموذج : 6-hydroxydopamine ( 6-ohda ) كان يستخدم لعلاج الخلايا العصبية الدوبامين مثل إصابة الخلايا العصبية الدوبامين الناجم عن التغيرات في معدل إفراز الدوبامين ، موت الخلايا المبرمج ، دراسة آلية تنكس الخلايا العصبية الدوبامين في مرض باركنسون .

مرض الزهايمر نموذج : تعامل مع اميلويد بيتا ( β ) للكشف عن مستويات البروتين تاو فوسفوريليشن وي تقلص نورایت وتحليل تأثير بيتا سمية على هيكل ووظيفة الخلايا العصبية .

من خلال هذه النماذج ، ونحن يمكن أن الشاشة المحتملة neuroprotective المخدرات ، مثل مضادات الأكسدة المضادة للالتهابات المخدرات ، وتقييم فعاليتها في إصلاح تلف الخلايا .

( ج ) إصلاح تلف الأعصاب وفحص المخدرات التغذية العصبية

في دراسة إصلاح تلف الأعصاب ، pc-12 تمايز الخلايا نموذج يمكن استخدامها لتقييم نشاط neurotrophic المخدرات : مرشح المخدرات ( مثل عامل التغذية العصبية ، neurojie غليكوزيد ) ومثقف مع تمايز الخلايا ، طول وعدد من نورایت شوهدت تحت المجهر ، والتعبير عن علامات العصبية ( مثل map2 ) تم الكشف عنها . في المختبر نموذج إصابة العصب ( على سبيل المثال ، نقص الأكسجة ، الإجهاد التأكسدي الناجم عن الإصابة ) ، معدل البقاء على قيد الحياة من الخلايا ، اللاكتات نازعة ( LDH ) الإصدار ( تعكس درجة تلف الخلايا ) تم الكشف عنها بعد تدخل المخدرات ، وبالتالي فإن تأثير اعصاب من المخدرات تم التحقق منها ، والتي يمكن أن توفر الأساس لتطوير الأدوية السريرية لعلاج إصابة العصب .

المسائل التي تحتاج إلى اهتمام في التطبيق التجريبي

مراقبة حالة التمايزتركيز المصل من نجف هو المفتاح لنجاح التمايز ، وانخفاض تركيز نجف ( أقل من 20 نانوغرام / مل ) يمكن أن يؤدي إلى انخفاض كفاءة التمايز ، عالية جدا ( > 100 نانوغرام / مل ) يمكن أن تزيد من معدل موت الخلايا المبرمج . انخفاض مستوى المصل ( 1 ٪ حصان + 1 ٪ مصل بقري جنيني ) يجب الحفاظ عليها بدقة ، وارتفاع تركيز المصل يمكن أن تمنع تشكيل نورایت . . . . . . .

نقاء الخلية ومكافحة التلوثالخلايا الليفية هي عرضة للتلوث في pc-12 خلية ثقافة ، والتي يمكن تنقيته من قبل الفرق في طريقة التصاق ( التصاق الخلايا الليفية بسرعة إزالة السائل بعد 1 ساعة ) . وفي الوقت نفسه ، ينبغي الكشف عن الميكوبلازما بانتظام ( 3 مرات في كل مرور ) ، الميكوبلازما التلوث يمكن أن يؤدي إلى انخفاض القدرة على التفريق بين الخلايا ، بعد التلوث يجب استخدام الميكوبلازما إزالة كاشف أو التخلص من الخلايا .

تفسير النتائج ووضع المقابلالعديد من الضوابط ، مثل مراقبة الخلايا غير متمايزة ، نجف السلبية السيطرة ( فقط مع انخفاض مستوى المصل الثقافة ) ، ينبغي أن توضع في التجربة . وعلاوة على ذلك ، على الرغم من أن الخلايا المتمايزة تمتلك خصائص مثل الخلايا العصبية ، فإنها ليست ناضجة الخلايا العصبية ( إذا لم يكن هناك نشاط الكهربية ) .

منتج مماثل يوصي