الكشف عن التهجين في الموقع

الأسماك طريقة التجربة والخطوات

واحد . التحقيق لمسخ

مسبار الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ( DNA ) كان لمسخ في درجة حرارة ثابتة 75 درجة مئوية حمام مائي لمدة 5 دقائق ، ثم وضعت على الفور في 0 درجة مئوية لمدة 5 ~ 10 دقائق .

ثانيا . عينة تنكس

① شرائح الزجاج من 5-8um كانت محمصة في 50oc الثقافة لمدة 2-3h . ( عينات مصبوغ مع جيمسا يجب أن تكون مخبوزة في حل ثابت قبل أن يتم خبز شرائح ) .

② شريحة زجاجية كانت مغمورة في 70 ～ 75oc لمسخ الحل 70 ٪ Formamide / 2 × التعاون فيما بين بلدان الجنوب لمدة 2 ～ 3 دقائق .

③ العينة على الفور من خلال حجم جزء من 70 ٪ ، 90 ٪ و 100 ٪ من حجم جزء من حجم الجليد الإيثانول سلسلة الجفاف ، 5 دقائق في كل مرة ، ثم الهواء الجاف .

ثالثا . تهجين

الحمض النووي التحقيق ( 10 μ ل ) الذي تم تعديله أو قبل الصلب ، انخفض إلى عينة من الزجاج الذي تم تعديله و المجففة ، ثم غطت مع 18 × 18 قطعة من الزجاج ، ثم تم تهجين 37 درجة مئوية في الرطب كاسيت بين عشية وضحاها ( حوالي 15 ~ 17 ساعة ) مع parafilm الختم . لأن هناك عدد أقل من السوائل المختلطة ، وارتفاع درجة حرارة التهجين و مدة طويلة ، من أجل الحفاظ على حالة رطبة من العينة ، هذه العملية تتم في الرطب مربع .

رابعا . مزال

هذه الخطوة تساعد على إزالة غير محددة ملزمة تحقيقات ، مما يقلل من الخلفية .

( 1 ) في اليوم التالي من التهجين ، عينة مأخوذة من درجة حرارة الغرفة 37oC ، مع شفرة بلطف إزالة الغطاء الزجاجي .

( 2 ) وضع شريحة زجاجية في 50 ٪ Formamide / 2 × SSC ، وغسلها لمدة 5 دقائق في كل مرة .

( 3 ) غسل 3 مرات في 1 × SSC مع 42 ~ 50oc مسخن لمدة 5 دقائق في كل مرة .

( 4 ) في درجة حرارة الغرفة ، الشريحة عينة غسلها برفق في 2 × التعاون فيما بين بلدان الجنوب .

( 5 ) إزالة الشريحة ، وتجفيف بطبيعة الحال .

( 6 ) 200 μ ل إعادة تلطيخ الحل ( بي / antifade أو دابي / antifade تلطيخ الحل ) أضيفت إلى عينة من الزجاج ، الزجاج مغطى .

خامسا . الأسماك نتيجة الفحص المجهري مضان