التهجين الجزيئي هو أداة أساسية في علم الأحياء الجزيئي للكشف عن الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ) أو البروتين . العملية يجب أن تتبع بدقة عملية موحدة لضمان دقة التجربة . وفيما يلي عملية الاستخدام الكامل والنقاط الرئيسية :

إعداد قبل التجربة

1 - إعداد العينات والتحقيق

- استخراج الحمض النووي المستهدف ( على سبيل المثال ، الحمض النووي الجينوم ، مرنا ) حسب الغرض من التجربة ، ثم نقل إلى دعم قوي ( النايلون / PVDF غشاء غشاء ) بعد الهضم و الكهربائي .

- وضع العلامات : يجب التحقق من نقاء وتركيز المسبار بواسطة النظائر المشعة ( 3 ² P ) ، والأصباغ الفلورية أو البيوتين المسمى اليغنوكليوتيد المسبار .

2 . أداة التفتيش

- التأكد من أن نظام التحكم في درجة الحرارة صك الهجين هو طبيعي ، وظيفة مستقرة من هزاز ، ختم المطاط الدائري لا الشيخوخة الضرر .

- التسخين المسبق للجهاز إلى درجة حرارة محددة مسبقا ( عادة 42-65 ℃ ، اعتمادا على نوع التحقيق ) ، والحد من تأثير تقلبات درجة الحرارة على كفاءة التهجين .

3 - تكوين الكواشف

- إعداد ما قبل التهجين السائل ( بما في ذلك الحمض النووي للحيوانات المنوية من سمك السلمون ، الحزب الديمقراطي الصربي ، وما إلى ذلك ) ، التهجين السائل التدرج تركيز الملح محلول التنظيف ، وإيلاء الاهتمام إلى الترشيح والتعقيم لتجنب التلوث .

العمليات الأساسية

1 . قبل التهجين

- وضع الغشاء الذي يجمد الحمض النووي لفحصها في أنبوب التهجين ، إضافة ما يكفي من السائل قبل التهجين غمر الغشاء ، احتضان 1-2 ساعات في درجة حرارة محددة . هذه الخطوة تهدف إلى إغلاق مواقع محددة ملزمة على الغشاء ، والحد من الضوضاء في الخلفية .

- * مفتاح التحكم * : الحفاظ على التذبذب طفيف لتعزيز الدورة الدموية السائل ، وتجنب توليد فقاعات الهواء .

2 - التهجين

- التخلي عن prehybrid الحل ، إضافة مباشرة إلى سائل يحتوي على علامة التحقيق ( التحقيق في التركيز النهائي هو عادة 1-10 نانوغرام / مل ) ، مواصلة الحضانة بين عشية وضحاها في التذبذب المعتدل ( 8-16 ساعة ) .

- * استراتيجية التحسين * : درجة حرارة التهجين = TM - 5 ℃ ( TM هو التحقيق في حل سلسلة درجة الحرارة ) ، مع مراعاة خصوصية وحساسية .

3 . غسل الفيلم الدرجات

- استخدام سوائل الغسيل المتتالية التي تقلل من تركيز الملح ( على سبيل المثال ، بالتتابع باستخدام 2 × SSC → 0.5 × SSC → 0.1 × SSC ) للتنظيف القطاعي لإزالة تحقيقات غير ملزمة أو غير متطابقة تدريجيا .

- * نصائح التشغيل : شفط السوائل المتبقية قبل كل تغيير ، دقة عالية الغسيل يمكن أن تزيد من خصوصية ، ولكن الإفراط في الغسيل يمكن أن يؤدي إلى فقدان إشارة حقيقية .

كشف الإشارة وتحليل البيانات

1 - الحصول على الصور

- اختيار وسائل الكشف المناسبة وفقا لنوع وسم المسبار : التصوير الشعاعي الذاتي يتطلب الضغط على الأشعة السينية؛ Chemiluminescent طريقة استخدام اتفاقية مكافحة التصحر التصوير ؛ تحقيقات الفلورسنت يمكن مسحها مباشرة .

- * التحكم في التعرض * : ضبط وقت التعرض لتجنب التشبع ، مزامنة إعدادات التحكم فارغة للقضاء على خلفية التدخل .

2 - تفسير النتائج

- التحليل الكمي باستخدام برامج imagej لحساب قيمة الشريط الرمادي ، نصف الكمية لتقييم مستوى التعبير الجيني . التحليل النوعي يركز على الاتساق بين موقف الفرقة وتوقع الوزن الجزيئي .

- * معالجة الاستثناء * : إذا كان غير محدد الشريط يظهر ، تحتاج إلى إعادة تحسين تصميم التحقيق أو تحسين دقة الغسيل .

العلاج والصيانة

1 - التخلص من النفايات

- معالجة النفايات السائلة التي تحتوي على نظائر وفقا لمواصفات النفايات المشعة ، وإعادة تدوير الكواشف الفلورية / Chemiluminescent في حاويات خاصة .

2 - صيانة الأجهزة

- إفراغ السائل في الأنبوب المهجن ، وغسلها بالماء النظيف ، ثم نقع في 70 ٪ إيثانول وتطهيرها ، ومعايرة أجهزة الاستشعار درجة الحرارة بانتظام .

- تسجيل المعلمات التجريبية ( درجة الحرارة ، سرعة الدوران ، والوقت ) في سجل المعدات للرجوع إليها في التجارب اللاحقة .

درجة الحرارة ، والوقت ، حل البيئة يجب أن تسيطر عليها بدقة في عملية التهجين الجزيئي الصك . ويقترح أن المستخدمين الأولية ينبغي أن تحمل على تجربة موازية للرقابة ، وأفضل حالة التهجين يمكن تحديدها من قبل التجربة . من أجل ضمان موثوقية النتائج التجريبية ، عملية موحدة ، جنبا إلى جنب مع تدابير صارمة لمراقبة الجودة .