خلاصة

في الجسم الحي electrotransformation تقنية شبكية العين في الفئران حديثي الولادة يوفر وسيلة رئيسية لدراسة الشبكية التنمية والمرض . الهدف من دراسة كفاءة نقل الجينات الأجنبية والتعبير في شبكية العين من الفئران حديثي الولادة ، وتحسين كفاءة ترنسفكأيشن ، وتوفير منصة تقنية موثوقة للبحوث الأساسية ذات الصلة الشبكية و الطب بالحركة .

مقدمة

شبكية العين ، باعتبارها واحدة من أهم الأنسجة البصرية إشارة الإرسال ، وقد تم التركيز على البحوث في مجال طب العيون . الهدف من دراسة تأثير الجينات على تمايز الخلايا ، والهجرة ، وإنشاء وظيفة الشبكية في الفئران حديثي الولادة . ومع ذلك ، هناك العديد من المشاكل مثل انخفاض الكفاءة ، تلف الخلايا ، وما إلى ذلك من الصعب تلبية متطلبات البحث العلمي الدقيق في الجسم الحي .

electrotransformation تقنية يمكن تغيير نفاذية غشاء الخلية على الفور من خلال نبض الحقل الكهربائي ، مما يجعل من جزيئات الحمض النووي الأجنبية تدخل الخلية ، مما يدل على التفوق في نقل الجينات في الأنسجة الحية . وينيد جين بولسر 830 مربع موجة الصعق الكهربائي يوفر كفاءة ودقة الحل في الجسم الحي electrotransformation الشبكية في الفئران حديثي الولادة ، مع مساعدة من التكنولوجيا المتقدمة مربع موجة النبض ، ذكي نظام الرصد ومرنة المعلمة الإعداد .

المواد والأساليب

1 - حيوانات التجارب

إن c57bl / 6j الفئران حديثي الولادة من 0-2 أيام بعد الولادة ( p0-p2 ) تم تغذيتها من قبل منتدى جنوب المحيط الهادئ الصف غرفة الحيوان في المختبر مع درجة الحرارة المحيطة ( 22 ± 2 ) ℃ ، الرطوبة 50 ٪ - 60 ٪ ، 12 ساعة الإضاءة / الظلام دورة .

2 - الكواشف الرئيسية

بلازميد الحمض النووي ( بما في ذلك الجينات المستهدفة هذه الشراكه ، التي شيدت من قبل المختبر ) ، كاشف ( المستخدمة في إعداد electrotransfer العازلة ، التي تحتوي على كلوريد الصوديوم ، ملعقة شاي ، الجلوكوز وغيرها من المكونات ، قيمة الرقم الهيدروجيني إلى 7-4 ) ، التخدير ( الأيزوفلورين ، تخدير الفئران ) ، مطهر كاشف ( 75 ٪ من الإيثانول ) .

3 - الصكوك الرئيسية

وينيد جين بولسر 830 مربع موجة الصعق الكهربائي ، stereomicroscope ( العلامة التجارية المستخدمة في عملية المراقبة ) ، microinjection إبرة ( 10-15 ميكرون في القطر الخارجي ، البلازميد حقن ) ، لوحة التدفئة درجة حرارة ثابتة ( الحفاظ على درجة حرارة الجسم في الفئران ) .

الخطوات التجريبية

التخدير و التثبيت في الفئران

الفئران حديثي الولادة وضعت في مربع تحتوي على التخدير الأيزوفلورين ، ثم نقلها إلى لوحة التدفئة درجة حرارة ثابتة للحفاظ على درجة حرارة الجسم مستقرة . استخدام شريط لاصق لتثبيت الماوس الرأس والأطراف بلطف ، لضمان استقرار الموقف أثناء العملية .

التعريب و حقن البلازميد الشبكية

في stereomicroscope ، بلازميد الحمض النووي تحتوي على الجينات المستهدفة ( تركيز 1-2 ميكروغرام / μ ل ) تم امتصاصه من قبل microneedle ، ثم تم حقن الفئران في تجويف زجاجي من هامش القرنية الزمنية ، ثم تم إدراج إبرة تلميح في تجويف زجاجي لتجنب العدسة . في عملية الحقن ، ينبغي إيلاء الاهتمام إلى السيطرة على عمق وسرعة حقن الإبرة ، وتجنب تلف أنسجة الشبكية .

3 . إعداد المعلمة وتشغيل الصعق الكهربائي

وفقا لخصائص أنسجة الشبكية من الفئران حديثي الولادة ، transfected طريقة خلايا الثدييات تم اختياره ، أوصت المعلمات من خلايا شبكية العين كانت تسمى : مربع موجة النبض ، والجهد هو تعديل حسب العمر و حجم مقلة العين من الفئران ( عادة 50-80v ) ، مدة النبض 10-20ms ، نبض عدد 3-5 ، نبض الفاصلة 1-2s . . . . . . .

جعل الخاص بك الملقط الكهربائي ( 1-2mm المسافة بين الأقطاب ، سطح معزول ، لتجنب تسرب الحالية ) بلطف المشبك الماوس مقلة العين ، لضمان أن القطب سطح مقلة العين عن كثب ، وليس الضغط على مقلة العين . بدء برنامج الصعق الكهربائي من خلال دواسة التبديل ، 10 بوصة شاشة تعمل باللمس يعرض نبض الموجي والمعلمات دينامية في الوقت الحقيقي ، والتي هي مريحة بالنسبة للمهندسين لرصد العملية برمتها . في عملية الصعق الكهربائي ، أداة يمكن الكشف عن مقاومة ذكية تلقائيا ، وقياس مقاومة العينة قبل النبض ، وضبط المعلمات بشكل حيوي ، وضمان أن كل حالة صدمة كهربائية مطابقة مع حالة خلايا الشبكية . وفي الوقت نفسه ، قوس حماية قطبية تحويل التكنولوجيا يمكن القضاء على الضرر من القوس الكهربائي ، وكسر حاجز تهمة من غشاء الخلية ، وتحسين معدل النجاح من الصعب transfected الخلايا .

4 - العلاج بعد الجراحة

بعد الانتهاء من عملية التحويل الكهربائية ، الماوس عاد إلى الأم الماوس للحفاظ على البيئة دافئة وهادئة . الهدف من مراقبة حالة العين والبقاء على قيد الحياة من الفئران كل يوم بعد العملية لضمان عدم حدوث العدوى وغيرها من المضاعفات .

النتائج والمناقشات

الكشف عن كفاءة تعداء

بعد 3 أيام من electrotransformation ، الفئران مقلة العين تم الحصول عليها و الشبكية المجمدة شرائح تم إعدادها ، والتعبير عن بروتين الفلورية الخضراء ( GFP ) لوحظ من قبل مضان المجهر . وأظهرت النتائج أن هذه الشراكه إشارات الفلورسنت يمكن ملاحظتها في كل طبقة من خلايا الشبكية ، ولا سيما في العقدة طبقة ، طبقة النواة الداخلية والخارجية طبقة النواة . هذا يرجع إلى قوة عالية المجال الكهربائي عابر تشكيل نفاذية غشاء الخلية من وينيد جين بولسر 830 مربع موجة الصعق الكهربائي الصك .

بقاء الخلية والأنسجة تقييم الضرر

هيكل شبكية العين لوحظ مع الهيماتوكسلين ( هو ) تلطيخ . كل طبقة من شبكية العين من الفئران في electrotransfer المجموعة كانت واضحة و الخلايا كانت مرتبة في النظام . التريبان الأزرق رفض التجربة أظهرت أن معدل البقاء على قيد الحياة من خلايا الشبكية بعد electrotransformation أكثر من 90 ٪ ، مما يدل على أن electrotransformation تقنية يمكن أن تقلل من تلف أنسجة الشبكية ، وضمان جدوى التجارب اللاحقة .

مقارنة مع التكنولوجيا التقليدية

الأساليب التقليدية تعداء ناقلات فيروسية لديها العديد من المشاكل ، مثل إعداد دورة طويلة ، وارتفاع التكلفة ، ومحدودية قدرة ناقلات ، وهلم جرا . وينيد جين نبض 830 مربع موجة الصعق الكهربائي بوساطة تقنية التحويل الكهربائي في الجسم الحي ، لا تحتاج إلى تغليف الفيروس ، يمكن مباشرة تسليم الحمض النووي الريبي والبروتين وغيرها من الجزيئات ، عملية بسيطة ، منخفضة التكلفة ، في حين تجنب المخاطر المحتملة من ناقلات الفيروس . كامل الطول الموجي ذكي نظام مراقبة يضمن الشفافية والتحكم في العملية التجريبية ، يمكن تتبع البيانات ، ويساعد على دقة تكرار نتائج البحث العلمي . قبل برمجة نظام التحسين يحتوي على خط الخلية المشتركة مكتبة المعلمة ، مفتاح واحد الدعوة ، وفي الوقت نفسه ، فإنه يدعم تعريف الذات نبض المعلمة .

التحسين التقني و الاحتياطات

في هذه التجربة ، تم العثور على المعلمات الأمثل الصعق الكهربائي هو عامل رئيسي يؤثر على كفاءة تعداء . . . . . . . overvoltage أو نبض التردد قد يؤدي إلى تلف الخلايا ، في حين أن انخفاض الجهد قد يؤدي إلى عدم كفاءة تعداء . . . . . . . ذكي وظيفة الكشف عن مقاومة وينيد جين نبض 830 يمكن ضبط المعلمات بشكل حيوي وفقا عينة المقاومة ، وبالتالي حل هذه المشكلة على نحو فعال . وبالإضافة إلى ذلك ، فإن تركيز وحجم حقن البلازميد ، درجة من الالتصاق الكهربائي و العمر اليومي من الفئران يمكن أن تؤثر على النتائج التجريبية .

احتمال تطبيق

مجال البحوث الأساسية

هذا الأسلوب يمكن أن تستخدم على نطاق واسع في البحث عن وظيفة الجينات المرتبطة شبكية العين التنمية ، مثل crispr تحرير الجينات جنبا إلى جنب مع electrotransformation . . . . . . . سيرنا التسليم يمكن أن تمنع التعبير عن الجينات المستهدفة ، واستكشاف آلية الجينات في التسبب في أمراض الشبكية . في دراسة الخلايا الجذعية إعادة برمجة ، electrotransformation التكنولوجيا يمكن أن كفاءة نقل برمجة العوامل في الخلايا الجذعية الشبكية ، وتوفير طريقة جديدة لدراسة الطب التجديدي في شبكية العين .

مجال الطب بالحركة

في الجسم الحي electrotransfer الورم ، يمكن أن تستهدف الشبكية وغيرها من أورام العين ، من خلال electrotransfer تسليم الجينات العلاجية أو المخدرات ، لتحقيق دقة العلاج المستهدف . في تطوير اللقاحات ، electrotransformation التكنولوجيا يمكن نقل الجينات إلى الخلايا المناعية المرتبطة مستضد الشبكية للحث على الاستجابات المناعية . في الجسم الحي ، العلاج الجيني ، أمراض الشبكية الوراثية ، مثل التهاب الشبكية الصباغي ، melanopathy الخلقية ، وما إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي إلى تحويل الجينات الطبيعية في خلايا الشبكية ، العلاج الجيني في التطبيق السريري إرساء أساس .

الزراعة والصناعة

على الرغم من أن هذه الدراسة تركز على شبكية العين من الفئران حديثي الولادة ، وينيد جين بولسر 830 مربع موجة الصعق الكهربائي لديها امكانات كبيرة في الزراعة والصناعة . في التحسين الوراثي للنباتات ، يمكن أن تستخدم في نقل الجينات النباتية البروتوبلاست وتسريع تحسين أصناف المحاصيل . في بناء هندسة الخميرة والكائنات الحية الدقيقة الهندسة الأيضية ، electrotransformation التكنولوجيا يمكن تحقيق كفاءة إدخال الجينات الخارجية ، وتحسين كفاءة الإنتاج من هندسة البكتيريا .

وينيد جين بولسر 830 مربع موجة الصعق الكهربائي ( SWPE ) وقد تم اختيار موثوق بها من قبل أكثر من 500 من كبار مؤسسات البحث العلمي مع مبتكرة SWPE التكنولوجيا ، ذكي نظام الرصد ، وعمق الدعم التقني . بغض النظر عن دقة التلاعب الجيني في البحوث الأساسية أو العلاج المبتكرة في الطب بالحركة ، الجهاز يوفر كفاءة عالية وموثوق بها منصة تقنية للباحثين . في الوقت الحاضر ، وينيد يوفر مجانا المشورة التقنية واختبار المنتجات والخدمات لمساعدة الباحثين على التغلب على الحواجز التقنية أمام تعداء ، وتعزيز البحوث في علوم الحياة والمجالات ذات الصلة .

المراجع

1 - التغيرات في الأوعية الدموية والأوكسجين الإجهاد ذات التعبير الجيني في الفئران حديثي الولادة اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين [ ي ] . يو تشنغ يانغ قونغ تشن يوان تشانغ قوه تشينغ . المجلة الصينية الصيدلة . 2014 , المرحلة 010

2 - التعبير عن البروتين وحيدة جاذب كيميائي في الفئران حديثي الولادة مع اعتلال الشبكية الناجم عن الأوكسجين [ ي ] . دونغ نينغ تشو لى تشون شياو لين . المجلة الصينية البصريات التجريبية . . . . . . . العدد 004

3 - التعبير عن البروتين جاذب كيميائي وحيدة في الفئران حديثي الولادة مع اعتلال الشبكية الناجم عن الأوكسجين [ ي ] . دونغ نينغ تشو لى تشون شياو لين . المجلة الصينية البصريات التجريبية . . . . . . . العدد 004

التعبير وأهمية mcp-1 في شبكية العين من الفئران حديثي الولادة [ ي ] . دونغ نينغ تشو لى تشون شياو لين . شاندونغ الطب . 2011 ، العدد 026

5 - التعبير عن mmp-2 في الفئران حديثي الولادة مع اعتلال الشبكية الخداجي [ ي ] . جيانغ شوانغ تشن شياو لونغ . مجلة كلية الطب . 2009 ، العدد 006