مقدمة

الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المخدرات كونجوجاتيس ( ADCS ) هو نوع من المنتجات البيولوجية العلاجية التي يمكن التعرف على الخلايا المستهدفة بدقة من خلال الأجسام المضادة ، من خلال الالتهام في الخلايا المستهدفة ، والإفراج عن اقتران المخدرات الجزيئية الصغيرة ، وبالتالي تحقيق الهدف المتمثل في قتل الخلايا المستهدفة ، والحد الأقصى من قتل الخلايا الطبيعية . بسبب مبدأ تصميم شركة تطوير العقبة ، وقد تم تصويرها على أنها " الصواريخ البيولوجية " ، منذ عام 2000 ، أول شركة تطوير العقبة المخدرات ميلوتارج ® بعد موافقة ادارة الاغذية والعقاقير ، 19 شركة تطوير العقبة قد تمت الموافقة عليها في جميع أنحاء العالم بحلول حزيران / يونيه 2025 . منذ عام 2023 ، شركة تطوير العقبة العالمية مجموع المبيعات تجاوزت 10 مليار دولار للمرة الأولى ، في عام 2024 ، شركة تطوير العقبة العالمية مجموع المبيعات استمرت في تجاوز 10 مليار دولار ، واصلت زخم النمو القوي .

في عام 2024 ، في المرتبة الثانية بين العشرة الأوائل في شركة تطوير العقبة في المبيعات العالمية هو kadcyla روش . المخدرات التي وافقت عليها ادارة الاغذية والعقاقير في عام 2013 لعلاج سرطان الثدي HER2 إيجابية ، مع المبيعات العالمية من حوالي 2.3 بليون دولار في عام 2024 . emetrazumab هو نوع من شركة تطوير العقبة التي تستهدف HER2 ، تحتوي على anti-her2-igg1-emetrazumab أنسنة الأجسام المضادة التي تربط بشكل تساهمي مع أنيبيب المانع ( DM1 ) عن طريق تثبيت thioether مفرق MCC ( 4 - [ ن - maleimidomethyl ] cyclohexane-1-carboxylate ) مع متوسط توزيع الوزن الجزيئي من 147 إلى 158kda و المخدرات / drug-3.5 ( daibodio 3 ) . بسبب تعقيد هيكلها ، فإنه من الصعب أن تمثل ذلك . في هذه الدراسة ، ونحن استخدام مطياف الكتلةالجيل الجديد من اثنين في واحد فائقة الدقة مطياف الكتلةإن kadcyla تتميز تماما ، مما يدل على قدرة ممتازة في تحليل الأدوية البيولوجية ، ولا سيما نقل الإلكترون التفكك بمساعدة عالية الطاقة تحطم تجزئة ( ETHCD ) وظيفة ، والتي يمكن أن تساعد على تحديد موقع اقتران المخدرات بدقة ، وتحديد بعد تعديل الترجمة ( PTM ) .

تطبيق تسليط الضوء على

كما ذكر أعلاه ، الجيل الجديد من اثنين في واحد فائقة الدقة قياس الطيف الكتلي Excedion برو biopharma ، صدر هذا العام ، وقد استخدم في مزيد من توصيف kadcyla . . . . . . . النقاط المضيئة في هذا الصك تشمل ولكن لا تقتصر على توسيع نطاق الكشف عن نوعية م / ض = 12 , 000 دا ( biopharma الخيار المطلوب ) ، والتي يمكن أن تلبي متطلبات غير التشويه والتحريف من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مونومر / ديمر / أرتب ، وغيرها من الوزن الجزيئي البروتين المجمعات . اختيار وظيفة ETD يمكن تحقيق سريع وحساس ETD / ETHCD تجزئة ، جنبا إلى جنب مع ارتفاع الطاقة تحطم تجزئة ( HCD ) ، والتي يمكن الحصول على معلومات كاملة عن تسلسل البروتين و PTM التغطية . هيكل excedion برو biopharma الصك هو مبين في الشكل 1 ، الشكل 2 يوضح عملية التمثيل في هذه التجربة .

الشكل 1 . excedion برو biopharma الهيكل ، مع تسليط الضوء على الأزرق بالمقارنة مع الأجهزة التحديثات من الجيل السابق من المنتجات . اختيار biopharma الطبعة يمكن توسيع نطاق اختبار الجودة إلى م / ض = 12 , 000 دا ( الأخضر مربع ) مع ETD / ETHCD تجزئة ( الأحمر مربع ) . ( انقر على عرض الصورة الكبيرة )

الشكل 2 . kadcyla توصيف تدفق الرسم البياني .

( انقر على عرض الصورة الكبيرة )

تنزلق إلى أسفل لعرض جميع المحتويات

تحديد كامل الوزن الجزيئي kadcyla تحت ظروف غير التشويه والتحريف

قياس الوزن الجزيئي الكامل هو أمر لا غنى عنه في توصيف المنتجات الصيدلانية البيولوجية - شركة تطوير العقبة ، بالإضافة إلى كامل الوزن الجزيئي ، متوسط قيمة دار و توزيع حمولة المخدرات ( DLD ) هي الخصائص الرئيسية لتقييم جودة الدواء . . . . . . . في هذه التجربة ، ونحن قياس الوزن الجزيئي الكامل kadcyla تحت nondegenerative الشرط . مقارنة مع تبديل طبيعة الظروف ، جزيئات البروتين هي أقرب إلى حالتها الطبيعية ، في ظل ظروف غير تبديل طبيعة البروتين أقل مشحونة كهربائيا ، وأقل التداخل بين المتاخمة الطيف الكتلي قمم الدول المشحونة كهربائيا ، والتي يمكن أن تقلل من التدخل المتبادل بين إشارات الطيف الكتلي ، مما يساعد على الحصول على أكثر دقة قياس الوزن الجزيئي الكامل النتائج . الشكل 3 يبين نتائج قياس الوزن الجزيئي الكامل في ظل حالة من kadcyla غير التشويه والتحريف . من أجل جعل عينة أقرب إلى الحالة الطبيعية ، ونحن لم desaccharided . . . . . . . كما هو مبين في الشكل 3 ، على المستوى الأصلي ، الطيف الكتلي القمم مع عدد مختلف من الأدوية و مختلف مكونات السكر بالإضافة إلى تحقيق خط الأساس الانفصال . بعد deconvolution ، اقتران المخدرات توزيع 0 ~ 8 يمكن ملاحظتها بوضوح ( الشكل 3 باء ) . biopharma مكتشف البرمجيات يمكن تلقائيا حساب متوسط قيمة دار ، ADC متوسط قيمة دار 3.47 ( الشكل 3 ) .

(أ)

(ب)

(ج)

الشكل 3 - تحديد كامل الوزن الجزيئي kadcyla تحت nondegenerative الشرط . A, الطيفية الأصلية والمحلية توسيع الرسم البياني . B, deconvolution الطيف . ج ، biopharma مكتشف البرمجيات يمكن تلقائيا اختيار المكونات ذات الصلة وحساب متوسط دار القيم . ( انقر على عرض الصورة الكبيرة )

تنزلق إلى أسفل لعرض جميع المحتويات

تعتمد على البيانات الثانوية تجزئة ETHCD المستخدمة في تحليل الرسم البياني الببتيد ،

تحقيق موقع اقتران وتحديد PTM

الببتيد تحليل الرسم البياني على أساس السائل مطياف الكتلة هي واحدة من الأساليب التحليلية المستخدمة عادة في توصيف المنتجات العلاجية البيولوجية ، والتي يمكن تحقيق تسلسل التغطية ، موقع مختلف التعديلات الكيميائية ، والتحليل النوعي والكمي بعد الترجمة المشتركة التعديلات . من بين العديد من تقنيات قياس الطيف الكتلي ( ماجستير ) تجزئة ، تجزئة HCD يستخدم على نطاق واسع في الببتيد تحليل الرسم البياني ، لأنها يمكن أن تنتج وفرة ب / ص شظايا من أيون الببتيد بعد كسر الروابط . ومع ذلك ، بالنسبة لبعض تعديل الببتيدات ، مثل glycopeptides و conjugator-drug-conjugation الببتيدات ، وما إلى ذلك ، لا يمكن تحديد المواقع بدقة عن طريق تجزئة قوات حرس السواحل الهايتية الببتيد مع العديد من المواقع المحتملة . وبالإضافة إلى ذلك ، بعض الببتيدات التي تحتوي على الأحماض الأمينية ايزومريزاسيون ، مثل لوسين / آيسولوسين ، الأسبارتات / أسبارتات ايزومريزاسيون ، الخ ، لا يمكن تمييزها بسبب نفس كتلة ب / ص الأيونات التي تنتجها HCD . ومع ذلك ، بسبب اختلاف آلية التفاعل ، ETD لا يمكن فقط الحفاظ على سلسلة الجانب تعديل مثل السكر و conjugator-drug اقتران ، ولكن أيضا يمكن أن تنتج أيونات مميزة لتشخيص ايزومريزاسيون الأحماض الأمينية ، وبالتالي تحديد وتمييز ايزومريزاسيون الأحماض الأمينية . ب / ص و ج / ض الأيونات يمكن الحصول عليها في وقت واحد في نفس الدرجة الثانية الأطياف ، والتي يمكن أن توفر معلومات أكثر شمولا من أجل تحقيق توصيف الببتيدات ، وخاصة تعديل / ايزومريزاسيون الببتيدات . Excedion برو اثنين في واحد فائقة الدقة مطياف الكتلة مع ETD الخيار يمكن تحقيق سريع وحساس ETD / ETCHD تجزئة ، والتي تعتمد على البيانات ETHCD الثانوية تجزئة ( بيانات تعتمد ETHCD MS2 ، دد ETHCD MS2 ) طريقة الحصول على البيانات ، والتي تعتمد على البيانات HCD الثانوية تجزئة ( دد HCD MS2 ) يمكن أن تكون متكاملة للحصول على تحليل شامل الببتيد الخريطة .

في هذه الدراسة ، ونحن استخدام trypsin و aspn لمسخ kadcyla ، على التوالي ، ثم أخذ عينات من اثنين من أنواع مختلفة من الأنزيمات البروتينية ، ونحن الحصول على البيانات من دد HCD MS2 و دد ethcd MS2 للحصول على معلومات عن تسلسل التغطية ، موقع اقتران التوزيع والترجمة بعد التعديل . 100 ٪ تغطية تسلسل حقن إبرة واحدة يمكن الحصول عليها باستخدام عينات من dd-hcd ms2 trypsin , و aspn enzymolysis . . . . . . . الشكل 4 يبين قاعدة الذروة الطيف ( BPC ) و تسلسل التغطية التي تم تحليلها من قبل عينة الببتيد الرسم البياني باستخدام د ethcd MS2 ، trypsin و aspn enzymolysis ، والتي يمكن أن تصل إلى 100 ٪ من تسلسل التغطية في نفس الوقت .

الشكل 4 . kadcyla الببتيد الرسم البياني هو الحصول على البيانات من نموذج دد etchd ms2 . . . . . . . اليسار ، تريبسين تحلل عينة . صحيح ، aspn enzymolysis عينة . من أجل حل بالإنزيم البروتيني عينات مختلفة ، 100 ٪ تسلسل التغطية يمكن أن تتحقق من خلال إبرة واحدة الحقن . ( انقر على عرض الصورة الكبيرة )

كما ذكر من قبل ، conjugator-drug ( mcc-dm1 ) من kadcyla هو تساهمي بالإضافة إلى ليسين ، المحطة الطرفية ن من تراستوزوماب هو أيضا بالإضافة إلى ذلك ، حتى أن هناك 92 مواقع اقتران المحتملة لكامل kadcyla جزيء ، 46 منها لا تتكرر ( الشكل 5 ) . بسبب الفراغية عائق بعد اقتران تساهمي من ليسين ، مما يؤدي إلى قطع trypsin راشح ، trypsin enzymolysis تنتج conjugator-drug-coupled الببتيد الجزء الذي يحتوي على العديد من ليسين ، في حين أن تجزئة قوات حرس السواحل الهايتية في وقت واحد يكسر الببتيد هيكل عظمي و المخدرات اقتران ، مما يؤدي إلى عدم القدرة على تحديد موقع اقتران المخدرات فقط من قبل قوات حرس السواحل الهايتية الثانوية الأطياف . بسبب اختلاف آلية تجزئة ، ethcd يمكن الحفاظ على المخدرات إلى جانب مجموعة في حين كسر الببتيد هيكل عظمي . الأمثل HCD مساعدة تجزئة الطاقة يمكن أن تجعل الببتيد تجزئة أكثر اكتمالا ، وفي الوقت نفسه الحفاظ على كامل اقتران المخدرات إلى أقصى حد . ويبين الجدول 1 من الدرجة الثانية تجزئة trypsin enzymolysis عينات باستخدام قوات حرس السواحل الهايتية و ethcd ، على التوالي ، معلومات موجزة عن المخدرات اقتران المواقع التي تم الحصول عليها ، من بين 46 تعديل المواقع المحتملة ، 43 المخدرات تم تحديد المواقع مع تعديل ethcd . ومن الواضح أن استخدام ethcd تجزئة ، الببتيد تحتوي على العديد من المواقع المحتملة اقتران ، اقتران المواقع يمكن أن تكون محددة بدقة ، جنبا إلى جنب مع نتائج قوات حرس السواحل الهايتية ، يمكن الحصول على معلومات كاملة ودقيقة اقتران المواقع .

الشكل 5 - كامنة في تعديل مواقع kadcyla جزيء ، والتي تم تحديدها في إطار أحمر ، ما مجموعه 92 موقعا ، منها 46 موقعا لا تتكرر .

( انقر على عرض الصورة الكبيرة )

الجدول 1 - ملخص kadcyla تحديد المواقع

( انقر على عرض الصورة الكبيرة )

الخط الأحمر ، إلى جانب الموقع . موقع اقتران يمكن تحديدها من قبل الثانوية شارد الأيونات . " + " ، الببتيد ، ولكن لا يمكن تحديد موقع معين من خلال اقتران شظايا الأيونات . " - " ، لم يتم التعرف على اقتران .

تنزلق إلى أسفل لعرض جميع المحتويات

عندما kadcyla هو enzymolysed مع ASPN ، الببتيد الجزء دك(216)ك(217)VEPك(221)سC， وأظهرت النتائج أن كل ثلاثة ليسين يمكن أن يقترن من خلال تحليل الببتيد صورة trypsin enzymolysis عينة . إن mcc-dm1 conjugator-drug من kadcyla يحتوي على مركز ايزوميريا ( الشكل 6 ، أعلى اليسار ) ، مما يؤدي إلى أن المخدرات إلى جانب الببتيدات هي مزال في عكس المرحلة الكروماتوغرافي في شكل قمم . كما هو مبين في الشكل 6 ، الببتيد الجزء دك(216)ك(217)VEPك(221)استخراج أيون تدفق الرسم البياني ( XIC ) من الشوري يظهر العديد من أزواج من القمم . الاستفادة من وفرة المعلومات الثانوية الأطياف التي تنتجها ethcd تجزئة ، فمن الممكن لتحديد المواقع التي الببتيد شرائح مزال في أوقات مختلفة الاحتفاظ اقتران ( الشكل 6 ، أدناه ) ، وحساب نسبة كل تعديل على أساس منطقة الذروة من xic ( الشكل 6 ، أعلى اليمين ) .

الشكل 6 - الببتيد شرائح تحتوي على عدة مواقع تم تحديدها من قبل ethcd اقتران . ( انقر على عرض الصورة الكبيرة )

في شركة تطوير العقبة ، بالإضافة إلى موقع اقتران المخدرات ، بعد تعديل الترجمة المختلفة ذات الصلة المخدرات الجودة تحتاج أيضا إلى وصف ورصد . الشكل 7 على أساس تجزئة الثانوية الأطياف ، الببتيد fnwyvisoد(283)تحديد نتائج gvevhnak Isomerization of أسبارتات . . . . . . . بسبب حساسية عالية و دقة عالية من منصة الصك ، حتى لو كان المحتوى النسبي هو فقط 0.18 في المائة من غير تعديل الببتيد الببتيد ايزومريزاسيون ، غنية ج / ض الأيونات يمكن تحديدها ، فضلا عن خصائص ج + 57 / z-57 الأيونات التي تنتجها ايزومريزاسيون أسبارتات في ETD تجزئة ، وبالتالي تحقيق ايزومريزاسيون تأكيد أسبارتات . النتائج الكمية النسبية يمكن الحصول عليها عن غيرها من التعديلات الشائعة بعد الترجمة ، مثل deamidation والأكسدة ارتباط بالغليكوزيل ( الشكل 8 ) .

الشكل 7 . isomerization من حمض الأسبارتيك أكد ethcd تجزئة . ج + 57 / z-57 الأيونات يمكن ملاحظتها في الرسم البياني أدناه . ( انقر على عرض الصورة الكبيرة )

الشكل 8 - مقارنة النتائج الكمية المشتركة الأخرى posttranslation التعديلات . جميع النتائج هي متوسط 3-needle د etchd MS2 تكرار الحقن . A, ميثيونين الأكسدة . B, أسباراجين دي أميد . C, اسباراجيناز succinimide . . . . . . . D, أكسدة اللونين . E, السلسلة الثقيلة n-glycation . . . . . . . ( انقر على عرض الصورة الكبيرة )

تنزلق إلى أسفل لعرض جميع المحتويات

ملخص

في هذه الورقة ، فإننا نقدم النتائج التجريبية من توصيف ليسين إلى جانب شركة تطوير العقبة kadcyla باستخدام الجيل الجديد من اثنين في واحد فائقة الدقة مطياف الكتلة excedion برو biopharma . . . . . . . توزيع المخدرات اقتران عدد من 0 إلى 8 يمكن الحصول عليها عن طريق قياس الوزن الجزيئي الكامل kadcyla تحت ظروف غير التشويه والتحريف ، ومتوسط قيمة دار 3.47 ، الذي يتفق مع التقرير 3-5 . سريعة وحساسة ethcd تجزئة يمكن ليس فقط تحقيق 100 ٪ تغطية تسلسل واحد إبرة الحقن ، وتحديد الكمية النسبية المشتركة بعد تعديل الترجمة ، ولكن أيضا تحقيق موقع اقتران وتحديد ايزومريزاسيون الأحماض الأمينية ، وهلم جرا .

المراجع :

[1] فو، ز، لي، س، هان، س. وآخرون. مضادات الدواء المقترنة: "الصواريخ البيولوجي" لعلاج السرطان المستهدف. Sig Transduct Target Ther 7, 93 (2022).

[2] https://assets.roche.com/f/176343/x/38d96ed8ec/fb24e.pdf

Joubert، N.، Beck، A.، Dumontet، C.، Denevault-Sabourin، C. مضادات الأجسام المخدرات: العقد الأخير. الصيدلانية 2020، 13، 245.

إذا كنت ترغب في التعاون في إعادة طبع هذه المادة ، يرجى ترك رسالة في نهاية المادة .