فلوري الكمية PCR ( qpcr ) هو أداة أساسية في مجال البيولوجيا الجزيئية البحوث السريرية التشخيص ( مثل الكشف عن فيروس كورونا الجديدة ) . تصحيح ( المعايرة ) هو خطوة رئيسية لضمان أداء مستقر من qpcr الصك . نظام التحكم في درجة الحرارة ( التحكم في درجة الحرارة الدقة ) و النظام البصري ( مضان إشارة الكشف ) يجب أن يكون بانتظام التحقق من تعديلها .

أولاً - الأهداف الأساسية للتصحيح

يهدف تصحيح جهاز QPCR إلى ضمان الامتثال لمؤشرات الأداء الرئيسية التالية :

نظام التحكم في درجة الحرارة : درجة الحرارة تشير إلى قيمة الخطأ ( مجموعة درجة الحرارة درجة الحرارة الفعلية الانحراف ) ، درجة الحرارة التوحيد ( رد فعل الفرق في درجة الحرارة بين الثقوب ) ، درجة الحرارة تقلب ( درجة الحرارة تتغير مع الوقت ) ، درجة الحرارة القصوى دفعة ( درجة الحرارة / درجة الحرارة في عملية التبريد تتجاوز مجموعة قيمة السعة ) ، متوسط معدل التبريد ( ارتفاع درجة الحرارة / سرعة التبريد ) .

النظام البصري : كثافة مضان الدقة ( الاتساق في إشارة مضان من نفس الحفرة ) ، عتبة دورة عدد ( CT ) الدقة ( الاتساق في مختلف القيم ثقب CT ) ، درجة حرارة انصهار ( TM ) الانجراف ( الانحراف في درجة الحرارة عند كثافة مضان النقصان بمقدار النصف ) ، معامل الارتباط الخطي ( العلاقة الخطية بين كثافة مضان و تركيز الحمض النووي ) .

ثانياً - الأعمال التحضيرية قبل التصحيح

1 - الظروف البيئية

درجة الحرارة : 15-30 ℃ ( تجنب تقلبات درجة الحرارة التي تؤثر على نتائج المعايرة ) ؛

الرطوبة النسبية : 20-85 ٪ RH ( منع الرطوبة من الصك ) ؛

إمدادات الطاقة : استقرار الجهد ( ينصح باستخدام يو بي إس ) ، وتجنب انقطاع التيار الكهربائي يؤثر على عملية المعايرة .

2 - المعدات والمواد

مواد مرجعية معتمدة ( على سبيل المثال ، بلازميد الحمض النووي ، الحمض النووي الريبي المواد المرجعية ) يجب أن تستخدم ، و قيمة مميزة ( عدد النسخ ≥ 10 ⁶ copies / μ ل ) و عدم اليقين النسبي ( أقل من 5 في المائة ) يجب أن تلبي متطلبات JF ( تيانجين ) 04-2020 .

معايرة المعدات : المحاكاة البصرية ( المتكاملة استشعار درجة الحرارة و انبعاث ضوء مولد ، قياس درجة الحرارة تتراوح من 0 إلى 120 درجة مئوية ، الحد الأقصى المسموح به خطأ ± 0.1 درجة مئوية ؛ انبعاث ضوء الطول الموجي 360-780nm ، قابل للتعديل كثافة الإشعاع النسبي ) ، متعدد القنوات معايرة درجة الحرارة ( مثل jdpc-96 لقياس درجة الحرارة بين الثقوب ) ؛

المواد الاستهلاكية : لوحة المعايرة الخاصة ( مثل ab7500 بالارقام معايرة لوحة ، لوحة المعايرة الخلفية ) ، ماصة ( 2 ميكرولتر ، 10 ميكرولتر ، وما إلى ذلك ، تحتاج إلى أن تكون مؤهلة للحصول على القياس والتحقق ) ، لا مسحوق قفازات ( منع التلوث معايرة لوحة ) .

ثالثاً - العمليات الرئيسية للتصحيح

معايرة تدفق qpcr الصك يجب أن تتبع بدقة JJF ( تيانجين ) 04-2020 " في الوقت الحقيقي الاسترداد الكمية الفلورسنت معايرة الصك القياسية " ، بما في ذلك أساسا نظام درجة الحرارة البصرية نظام المعايرة المعايرة جزأين .

( أ ) معايرة نظم الحرارة

درجة الحرارة هي معلمة أساسية في تفاعل البلمرة المتسلسل ( qpcr ) . معايرة نظام درجة الحرارة يحتاج إلى استخدام المحاكاة البصرية ( بدلا من رد فعل أنبوب ) لمحاكاة التغيرات في درجة الحرارة في رد فعل حقيقي ، والتحقق من أداء التحكم في درجة الحرارة من الصك .

1 . إعداد قبل المعايرة

محاكاة البصرية ترتبط مع qpcr الصك ، الذي يضمن أن استشعار درجة الحرارة في الجزء السفلي من جهاز استشعار درجة الحرارة في اتصال جيد مع مصدر الضوء الفلورية المنبعثة من الجزء العلوي من الجهاز .

تطبيق إجراء الحرارة النفط في المحاكاة البصرية لتعزيز التوصيل الحراري .

فتح أداة البرمجيات ، حدد " معايرة " وحدة ، أدخل " معايرة درجة الحرارة " البرنامج .

2 - إجراءات المعايرة

التسخين : وضع درجة حرارة 23 ℃ ، تشغيل برنامج التسخين ( حوالي 10 دقائق ) ، حتى أن الصك إلى حالة مستقرة .

درجة الحرارة الإعداد : اختيار 9 نقاط درجة الحرارة ( 30 ℃ 50 ℃ 60 ℃ 70 ℃ 90 ℃ 95 ℃ الخ ) ، كل نقطة درجة الحرارة لمدة 2 دقيقة ( لقياس درجة الحرارة يدل على خطأ ، التوحيد ، تقلب ) ؛

ارتفاع درجة الحرارة / عملية التبريد : ارتفاع درجة الحرارة من 50 ℃ إلى 90 ℃ ( قياس متوسط معدل التسخين ) ، ثم من 90 ℃ إلى 50 ℃ ( قياس متوسط معدل التبريد ) ؛

الحصول على البيانات : درجة الحرارة الإعداد ( TS ) ، متوسط درجة الحرارة الفعلية ( t ₁ ) تذبذب درجة الحرارة ( t u v ) و أقصى قدر من تجاوز قيمة ( t u os ) سجلت تلقائيا في كل درجة حرارة نقطة .

3 - حساب النتائج

خطأ في درجة الحرارة : △ ر = ts-t ₁ ( شرط ≤ ± 0.5 ℃ ) ؛

درجة الحرارة التوحيد : △ تو = t u umax-t umin ( t u umax هو أقصى درجة حرارة المسام ، t u umin هو الحد الأدنى ، شرط ≤ 1 ℃ ) ؛

تذبذب درجة الحرارة : △ ت ت =± ( t △ u max-t △ u مين ) / 2 ( t △ u max هو أقصى درجة حرارة المسام ، t u min هو الحد الأدنى ، شرط ≤ 0.2 ℃ ) ؛

درجة الحرارة القصوى overimpulse ] : تي يو اس = tosmax-ts ( tosmax هو الحد الأقصى من overimpulse جميع الثقوب ، شرط ≤ 3 ℃ ) ؛

متوسط معدل التسخين : v u up = ( tb-ta ) / tut ( tb = 90 ℃ ، تا = 50 ℃ ، tut = 4 ℃ / ثانية ) ؛

متوسط معدل التبريد : v u down = ( السل - تا ) / TDO ( TDO هو وقت التبريد ، شرط ≥ 3 ℃ / ثانية ) .

` 2 ` معايرة النظم البصرية

النظام البصري هو المسؤول عن الكشف عن إشارة مضان ، ودقة يؤثر بشكل مباشر على قيمة الاشعة و تركيز الحمض النووي من النتائج الكمية . معايرة النظام البصري يتطلب استخدام لوحة المعايرة الخاصة ( مثل ab7500 بالارقام معايرة لوحة ) لضبط حساسية كاشف مضان إشارة الاتساق .

1 - معايرة الخلفية

الهدف : القضاء على التدخل من خلفية مضان ( مثل الإشارات الإلكترونية ، والمواد الاستهلاكية البلاستيكية التلوث ) ؛

خطوات

( 1 ) إزالة الخلفية معايرة لوحة ( وضع في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لتجنب الماء المكثف ) ؛

( 2 ) تحميل لوحة المعايرة في الصك وتشغيل برنامج " معايرة الخلفية " ( حوالي 30 دقيقة ) ؛

( 3 ) البرمجيات تلقائيا تسجيل إشارة مضان الخلفية ، وتوليد خلفية تصحيح الملف ( بعد التجربة تلقائيا خصم ) .

2 . العائد على الاستثمار ( منطقة الفائدة ) المعايرة

الهدف : رسم حفرة على لوحة رد فعل على كاشف الصك ، وضمان دقة جمع إشارة مضان من كل حفرة .

خطوات

( 1 ) إزالة لوحة المعايرة بالارقام ( لوحة قياسية أو لوحة سريعة ، تحتاج إلى التمرير لمدة 5 ثوان و الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة ) ؛

( 2 ) وضع لوحة المعايرة في الصك وتشغيل " العائد على الاستثمار المعايرة " الداخلي ؛

( 3 ) البرنامج تلقائيا يلتقط صورة كل مرشح ، ويولد قناع بالارقام ( الدائرة الخضراء حول كل حفرة ، مما يدل على نجاح المعايرة ) ؛

( 4 ) إذا كانت الصورة أكثر من التشبع ( كثافة مضان في حفرة ) ، تحتاج إلى ضبط وقت التعرض ( على سبيل المثال ، من 2048 إلى 1024 ) ، وإعادة جمع الصورة .

3 - المعايرة البصرية

الهدف : تعويض الآثار المادية من النظام البصري ( على سبيل المثال ، استجابة طيفية من مرشح بصري ) لضمان دقة إشارة مضان .

خطوات

( 1 ) حدد " إجراء المعايرة البصرية " وتحميل ملف المعايرة بالارقام؛

( 2 ) تشغيل البرنامج ( حوالي 10 دقائق ) ، والبرمجيات تلقائيا تحليل الخصائص الطيفية للإشارات الفلورية ، وتوليد ملفات إيجابية للمدارس الخفيفة .

4 . صبغ المعايرة

الهدف : التحقق من دقة إشارة مضان من الأصباغ المختلفة ( على سبيل المثال ، فام ، فيك ، روكس ) لضمان موثوقية متعددة صبغ التجربة .

خطوات

( 1 ) إزالة الصبغة معايرة لوحة ( بما في ذلك مجموعة متنوعة من الأصباغ الفلورية ، مثل CY3 ، CY5 ، فام ، الخ ) ؛

( 2 ) وضع لوحة المعايرة في الصك ، تشغيل " صبغ معايرة " الداخلي ؛

( 3 ) البرنامج تلقائيا بجمع أطياف الفلورية من كل صبغة ، ويولد صبغ تصحيح الملف ( تلقائيا تحديد صبغ إشارة في التجارب اللاحقة ) .

` 3 ` تسجيل النتائج والشهادات

بعد الانتهاء من المعايرة ، معايرة شهادة معتمدة من برنامج أكاديمية سيسكو ، بما في ذلك ما يلي :

( 1 ) المعلومات الأساسية عن الصك ( النموذج ، الرقم المسلسل ، الشركة المصنعة ) ؛

( 2 ) معايرة الظروف البيئية ( درجة الحرارة والرطوبة والوقت ) ؛

( 3 ) نتائج المعايرة ( درجة الحرارة تشير إلى خطأ ، التوحيد ، دقة النظام البصري ، الخ . )

( 4 ) توقيع موظفي المعايرة ومراجعي الحسابات؛

( 5 ) مؤهلات مؤسسات المعايرة ( رقم اعتماد برامج أكاديمية سيسكو ) .

رابعاً - اعتبارات التصحيح

1 - فترة المعايرة

ومن المستحسن أن معايرة كاملة تتم كل 12 شهرا ( تلبية متطلبات JJF ( تيانجين ) 04-2020 ) .

استخدام عالية التردد ( مثل تشغيل أكثر من 10 مرات في اليوم ) أو التطبيقات الرئيسية ( مثل التشخيص السريري ) يمكن اختصارها إلى 6 أشهر .

بعد أداة نقل أو إصلاح أو استبدال المكونات الرئيسية ( مثل كتلة التدفئة ، كاشف ) ، تحتاج إلى إعادة معايرة .

2 - الدعم المهني

المعايرة يجب أن يقوم بها مهندس مصنع أو طرف ثالث مؤهل ( على سبيل المثال ، وتيانجين القياس والإشراف والتفتيش معهد بحوث العلوم ) لضمان الامتثال سوب ( معيار التشغيل الداخلي ) ؛

يحظر على غير المهنيين ضبط المعلمات الصك ( مثل درجة الحرارة الإعداد ، مرشح بصري ) لتجنب التأثير على نتائج المعايرة .

3 - التحقق بعد المعايرة

بعد المعايرة ، ونحن بحاجة إلى تشغيل اختبار المواد المرجعية ( مثل بلازميد الحمض النووي مادة مرجعية معيارية ) للكشف عن التكرار ( معامل الاختلاف ≤ 3 ٪ ) و معامل الارتباط الخطي ( ص ≥ 0.99 ) لضمان معايرة تأثير .

إذا كانت نتائج التحقق لا تلبي الاحتياجات ، تحتاج إلى إعادة معايرة أو الاتصال بالشركة المصنعة للصيانة .

خامساً - المشاكل المشتركة والحلول

1 . درجة الحرارة التوحيد لا تلبي متطلبات

السبب : متوسط كتلة الحرارة والتلوث ( مثل المنتجات PCR المتبقية ) ، وأجهزة الاستشعار درجة الحرارة الشيخوخة ؛

الحل : تنظيف حتى كتلة الحرارة ( مسح مع الكحول المطلق ) ، واستبدال أجهزة استشعار درجة الحرارة .

2 . انخفاض كثافة إشارة مضان

السبب : عدم معايرة بالارقام ( ثقب الخريطة خطأ ) و الخلفية مضان عالية جدا .

الحل : إعادة معايرة بالارقام ، تشغيل الخلفية معايرة ( استبدال الخلفية معايرة لوحة ) .

3 . CT قيمة الاختلاف الكبير

السبب : درجة الحرارة تقلب يتجاوز المعيار ( على سبيل المثال ، تدفئة كتلة غير مستقرة ) ، كاشف مضان حساسية النقصان .

الحل : التحقق من استقرار درجة الحرارة من كتلة التدفئة ( تقاس متعدد القنوات معايرة درجة الحرارة ) ، واستبدال كاشف مضان .

سادساً - ملخص

معايرة مضان الكمية PCR هو خطوة رئيسية لضمان دقة وموثوقية البيانات التجريبية ، يجب أن تتبع بدقة معايير الصناعة ( مثل jjf1527-2015 و jjf ( تيانجين ) 04-2020 ) ، معايرة نظام التحكم في درجة الحرارة و النظام البصري بانتظام . في عملية المعايرة ، ينبغي إيلاء الاهتمام إلى الظروف البيئية ، والدعم المهني ، والتحقق من النتائج ، لضمان أن أداء الجهاز يتوافق مع متطلبات التجربة . من خلال تصحيح تدفق القياسية ، يمكن أن تقلل بشكل فعال من الأخطاء التجريبية ، وتحسين دقة والتكرار من qpcr النتائج .