تشريح أوليمبوس مضان المجهر

2018 / 7 / 26 7 : 52 : 45 الناشر : admin

بالمقارنة مع غيرها من العينات على أساس الخصائص العيانيةالمجهر الضوئيعلى سبيل المثال ، مرحلة التدرج ، امتصاص الضوء ، انكسار ، مجهر فلوري يمكن تصوير توزيع الأنواع الجزيئية الفردية فقط على أساس خصائص انبعاث مضان . وبناء على ذلك ، فإن الموقع الدقيق من المكونات داخل الخلايا المسمى مع مجموعات محددة من مضان ، وما يرتبط بها من معاملات الانتشار ، خصائص النقل ، وما يرتبط بها من عناصر أخرى يمكن رصدها باستخدام مضان المجهر .علم الأحياءالتفاعل الجزيئي . وبالإضافة إلى ذلك ، استجابة كبيرة من مضان للمتغيرات البيئية المحلية تمكن من دراسة درجة الحموضة ، اللزوجة ، معامل الانكسار ، تركيز أيون ، غشاء المحتملة المذيبات القطبية في الخلايا الحية والأنسجة .

في وقت مبكر من مضان المجهر تكوينات استخدام الكلاسيكي مشرق أو حقل الظلام انتقال )انتقال الضوءونظام بصريضوء الإثارة من خلال تصفية تركز على عينة الطائرة . مضان الانبعاثات والكثير من الإثارة تشعيع يتم جمعها من خلال عدسة الهدف ، ومن المتوقع في العدسة الحاجز من خلال تصفية الثانية على شكل صورة متوسطة . لأن كثافة الضوء المنبعث عادة عدة أوامر من حجم أكبر من مضان الانبعاثات ، عينة وجهات النظر في هذه أوائل انتقال المجهر الضوئي عادة ما تكون منخفضة جدا على النقيض من ذلك و فرضه على خلفية مليئة غيوم الإثارة . باستخدام عالية الفتحة العددية النفط مغمورة حقل مظلم المكثف لإلقاء الضوء على عينة مع ارتفاع الميل السمت يساعد على القضاء على معظم الضوضاء في الخلفية ، ولكن لا يكفي الإضاءة المقدمة باستثناء انخفاض الفتحة العددية الهدف . الصورة الناتجة عن سوء القرار ، سطوع منخفضة جدا .

مجهر فلوري مع الضوء الساقط )انعكاس الضوءأو إسقاط ) الإضاءة وضعت في وقت مبكر في أواخر العشرينات من القرن الماضي ، وتستخدم لمراقبة الانبعاثات الفلورية في عينات معدنية مبهمة . مثل نظرائهم في مجال مشرق ، هذه الأجهزة استخدام نصف عاكس مضان شعاع الفاصل ، مع الكفاءة الإجمالية حوالي 25 ٪ ( 50 ٪ من الإضاءة المفقودة في كل مرة يمر من خلال المرآة ) . ومع ذلك ، يعكس ضوء الفلورسنت المجهر تتمتع بمزايا عالية الفتحة العددية عدسة الهدف مثل المكثف ، وقادرة على توليد صورة مع مستوى أعلى بكثير من انتقال ضوء المجهر تعمل تحت نفس الفتحة العددية . وبالإضافة إلى ذلك ، فإن الإثارة الضالة الضوء المنعكس من العدسة الشيئية ( في الفتحة العددية العالية ) انخفض إلى بضعة في المئة فقط . وظيفة مزدوجة من العدسة الشيئية في ضوء يعكس المجهر أيضا يبسط إلى حد كبير محاذاة المهمة . مجال الإضاءة و مجال الرؤية هي التي شيدت فقط من خلال التركيز على عدسة الهدف على عينة ، مثل أن الحادث ضوء الإثارة لاحظ انبعاث مضان تتبع نفس المسار من خلال سلسلة البصرية المجهر .

عندما تم تطوير بخار الزئبق المضغوط ومصابيح زينون قوس التفريغ في منتصف الثلاثينات من القرن الماضي ، أدى التقدم التكنولوجي في مصادر الإضاءة إلى إحداث تحول في مضان الضوء المنعكس ( على الأقل في علم المعدغرافيا دراسة المعادن ) . خلال هذه الفترة ، الزجاج الملون و الجيلاتين مرشحات أصبحت أكثر تعقيدا ، مما يتيح استخدام مصابيح الهالوجين التنغستن تطبيق الأصباغ الفلورية متحمس من الضوء المرئي الأزرق والأخضر . طلاء مضاد للانعكاس وتحسين صياغة الزجاج أدى إلى تحسن كبير في تصميم العدسة الشيئية في الأربعينات من القرن الماضي ، ولكن المساهمة الأساسية في تطوير ضوء الحادث المجهري مضان هو إدخال ثنائي اللون الطيفي ( المعروف أيضا باسم ثنائي اللون مرآة ) التي بدأها عالم البصريات الروسي يوجيني بلومبرغ في عام 1948 . هذا الابتكار يتغلب على مشكلة فقدان الضوء المتأصلة في استخدام مرآة تعكس الضوء العادي في المجهر . في أوائل الستينات ، يوهان س . ploem تجاريا على نطاق واسع ، وقد لعبت دورا هاما في تطوير واسعة النطاق ليتز ploem opak ، بما في ذلك العديد من وحدات بصرية قابلة للتبديل ، جنبا إلى جنب مع مجموعة متنوعة من مضان المجهر مرشحات .

الاستراتيجية الأساسية من السقوط المجهري مضان

معظم الضوء المنعكس مضان المجهر هي الخيارات الحالية في مجال واسع من مصادر الضوء غير متماسكة ، فضلا عن تلك التي أجريت مع ليزر متحد البؤر المسح الضوئي و multiphoton الصكوك . هذا النمط المعروف أيضا باسم مضان المجهر مضان الضوء الساقط ، يعكس ، أو مجرد قطرة مضان . نموذجي الحديثة تعكس ضوء مضان المجهر مجهز أيضا مع ضوء انتقال الملاحظات في مختلف طرق تعزيز النقيض ، كما هو مبين في الشكل 1 . المجهر يتكون من رئيس المراقبة الثلاثية ، بالإضافة إلى اتفاقية مكافحة التصحر نظام التصوير ، مع اثنين من مصادر الإضاءة ، واحد لنقل الضوء ، والآخر لمراقبة ( التنغستن الهالوجين والزئبق قوس التفريغ ، على التوالي ) . يمكن الجمع بين تصميم المجهر أو بالتناوب تعكس ضوء الفلورسنت مع ضوء انتقال النقيض المرحلة ، وعلى النقيض من التدخل التفاضلية ( DIC ) ، وعلى النقيض من الضوء المستقطب أو تعديل هوفمان للمراقبة .

الميزة الأساسية من أي مجهر فلوري هو توفير آلية لتحفيز عينة انتقائي تصفية الإضاءة ، ثم استخدام الفلتر الثاني لفصل أضعف انبعاث مضان على شكل صورة مع حساسية كبيرة على خلفية مظلمة . في العديد من التجارب ، التحقيق المحلية تركيز منخفض جدا في العينات البيولوجية ، سوى جزء صغير من الضوء المنبعث من امتصاص المواد الفلورية . وعلاوة على ذلك ، فإن نسبة انبعاث مضان الثانوية حتى أقل من تلك التي تمتص كمية معينة من الإشعاع . الحصول على انبعاث مضان مستوى السطوع سوف تكون ثلاثة إلى ستة أوامر من حجم أقل من مستوى الإضاءة . وهكذا ، فإن المشكلة الأساسية من المجهر مضان هو توليد الإضاءة عالية الكفاءة من العينة ، في حين التقاط انبعاث مضان ضعيفة بشكل فعال فصل من أكثر كثافة الإشعاع في المنطقة . هذه الشروط يمكن أن تتحقق من خلال الجمع بين مرشحات الضوء التي تتوافق مع الإثارة و الانبعاثات المطلوبة على أساس ثنائي اللون شعاع الفاصل في الحديث مضان الصكوك .

الشكل 2 يلخص المبادئ الكامنة وراء وظيفة شعاع الفاصل ( مرآة ) في ضوء الفلورسنت عاكسة المجهر ، بما في ذلك عينة افتراضية من المجموعة التي تثير تنبعث منها مضان أحمر ( 620-660 نانومتر ) الطول الموجي في المنطقة الخضراء ( 550 نانومتر ) . الطيف المرئي . عالية الكثافة مصدر الضوء النواتج مجموعة واسعة من الإثارة الأطوال الموجية في كثافة تدفق عالية ( عادة ما تغطي معظم الأشعة فوق البنفسجية كامل الطيف المرئي ) التي تمر من خلال الإضاءة و أول من واجه مرشح ( المسمى EF ؛ انظر الشكل 2 ( أ ) الذي يختار المناسب الإثارة باند ) . في هذه الحالة ، مرشح تمرير الضوء مع كفاءة عالية في الطول الموجي بين 510 و 560 نانومتر ، ولكن أيضا يسمح أطوال موجية أخرى لتمرير في درجات أقل . ضوء الإثارة ثم تصل إلى مرآة اللونين ( مارك ألماني في الشكل 2 ) و ينعكس في الفتحة الخلفية من العدسة الشيئية على شكل مخروط الإضاءة المشع عينة . مرآة اللونين يقع في مسار الضوء بزاوية 45 درجة مصممة بشكل انتقائي يعكس الطول الموجي بين 490 و 565 نانومتر ( الشكل 3 ) ، في حين نقل أقصر وأطول أطوال موجية .

ويبين الشكل 3 انتقال منحنى الجمع بين ضوء الإثارة مع فلتر لفصل انبعاث مضان في الشكل 2 . الإثارة مرشح الطيف ( الأحمر منحنى ) يظهر مستوى عال من انتقال ( حوالي 80 في المائة ) بين 510 و 560 نانومتر . مركز الطول الموجي ( CWL ) 535 نانومتر . مرآة اللونين ( الأصفر منحنى ) يعكس الطول الموجي في المنطقة الطيفية من الإثارة ، في حين تمر من خلال ارتفاع وانخفاض الطول الموجي مع كفاءة عالية نسبيا . لاحظ أن نسبة انتقال على منحنى ثنائي اللون مرآة يتوافق مع 100 ٪ انعكاس . انخفاض كبير في انتقال التوزيعات بين 490 و 570 نانومتر ( الذي يمثل ذروة الانعكاس ) يستخدم تعكس الطول الموجي الفرقة التي تدخل العينة في زاوية 90 درجة من الإثارة فلتر . العنصر الأخير في سلسلة البصرية ، أي انبعاث أو حاجز فلتر ( منحنى أبيض ) ، ينقل أطوال موجية أعلى من 590 نانومتر ، والتي تتوافق مع الضوء المرئي مع الأصفر والبرتقالي والأحمر . الحدود بين مختلف الأطياف تراكب الإرسال والانعكاس نطاقات مصممة لتكون حادة قدر الإمكان لضمان الانعكاس والانعكاس أطوال موجية منفصلة تقريبا . نمط جيبي الارتفاع والانخفاض في ذروة الطيف ديتشرويسم هو تأثير شائع في عملية ترسب الفيلم ، والمعروفة باسم رنين دون توقف . أداء هذا الفلتر هو مزيج ممتاز ، مما يدل على التطور السريع في تكنولوجيا الأغشية الرقيقة تدخل فلتر .

لأن الضوء فقط مع عرض النطاق الترددي الضيق ينعكس من قبل اثنين من لون المرآة ، الطول الموجي للإشعاع الذي هو أقصر من 490 نانومتر و أطول من 565 نانومتر من خلال الإثارة مرشح يمكن أن تنتقل أيضا من خلال اثنين من لون المرآة ، كما هو مبين في ضوء قطع أعلاه . في الشكل 2 ( أ ) . لاحظ أن الضوء المنعكس من الإثارة ليست 100 ٪ فعالة ، حتى كمية صغيرة من الضوء الأخضر يمر من خلال مرآة ديتشرويك دون أن تنعكس . وبالإضافة إلى ذلك ، ليس كل من الطول الموجي للضوء أكبر من 565 أو أقل من 490 نانومتر يمر من خلال المرآة . جزء صغير من هذا الضوء ينعكس على عينة من خلال عدسة الهدف من المرآة .

انبعاث مضان من عينة ( أساسا الطول الموجي الأحمر ) متحمس من الضوء الأخضر هو جمعها من خلال عدسة الهدف و يمر من خلال عدسة ديتشرويسم و حاجز فلتر ( الشكل 2 ( ج ) أعلاه قطع الضوء ) . حاجز الفلاتر ( المسمى BF في الشكل 2 ، مصممة خصيصا للسماح فقط أطوال موجية للضوء أكبر من 590 نانومتر للوصول إلى العدسة المجهر و / أو الكاشف . في هذه المهمة ، حاجز فلتر فعال يمنع الإثارة الطول الموجي للضوء المنعكس من عينة ( بنجاح من خلال مرآة اللونين ) من الوصول إلى الكاشف . ومع ذلك ، فإن معظم الطول الموجي الإثارة عاد من العينة ينعكس على الإثارة فلتر و luminophor من ديتشرويسم ( ضوء أقل من قطع الضوء في الشكل 2 ( ج ) . صافي تأثير فلتر الترتيب المبين في الشكل 2 و 3 هو فصل ضوء الإثارة مع كثافة أعلى بكثير من ضعف مضان الانبعاثات . في جميع الحالات ، كما هو مبين في الرسم البياني ، قطع مستوى الفلاتر في المجهر مضان ليست هي نفسها ، ولكن بعض الضوء خارج نطاق الطول الموجي يمكن أن تخترق . الشكل 2 ( ب ) يبين بيانيا كامل تسلسل الأحداث ، مما يدل على مسار بصري واستراتيجية تصفية الترتيب المطلوب من أجل فعالية تعكس ضوء الفلورسنت المجهر .

عمودي إضاءة الفلورسنت

جوهر المجهر الفلورسنت الحديثة هو عالمي يعكس الضوء عمودي الإضاءة .عدسة الهدفبين المحولات ، كما هو مبين في الشكل 1 والشكل 4 . إنارة مصممة لتوجيه الضوء المتولد من ضوء عالية - كثافة مصدر يوضع على العينة عن طريق تمرير الضوء من خلال العدسة الشيئية المجهر نحو اتجاه العينة ، ثم التقاط الضوء المنبعث من العينة باستخدام نفس العدسة الشيئية . هذا النوع من استراتيجية الإضاءة والعديد من المزايا . المجهر الهدف هو أولا بمثابة تصحيح المكثف ، ثم جمع التصوير مضان الانبعاثات من أجل نقلها إلى العدسة أو الكاميرا نظام الكشف . ولذلك ، عدسة الهدف دائما الانحياز بشكل صحيح بالنسبة إلى كل وظيفة . وعلاوة على ذلك ، فإن معظم الضوء المنعكس أو غيوم من العينة ( في زاوية 360 درجة ) هو بعيدا عن عدسة الهدف الأمامي عنصر بدلا من المتوقع مباشرة في الزجاج ، كما هو الحال مع انتقال مضان التشعيع . ويسمى هذا التأثير الإضاءة الأمامية ، وخاصة بالنسبة للعينات سميكة . بعد التشعيع ، عينة المنطقة يقتصر على نفس المنطقة التي لوحظت ، والإضاءة ضوء جمع يمكن الاستفادة من كامل الفتحة العددية من العدسة الشيئية .

في النهاية البعيدة من عمودي إضاءة مصباح مربع ( انظر الشكل 4 ) ، الذي يحتوي على كثافة عالية قوس التفريغ أو خيوط مصباح وهاج مصدر الضوء . مصدر الإضاءة شعبية هو مصباح القوس الزئبق الضغط العالي 100 واط ( HBO ، المعروف عادة باسم الموقد ) ، ولكن زينون ومصابيح القوس هالوجين معدنية ، ليزر ومصابيح التنغستن المتوهجة هالوجين متاحة أيضا لهذا الغرض . الضوء المنبعث من مصدر الضوء هو التركيز من خلال عدسة المكثف نظام السفر على طول الجزء الداخلي من إنارة بالتوازي مع سطح المكتب و عمودي على المحور البصري من المجهر . إن luminophor تصميم كما هو مبين في الشكل 4 يتضمن عنصر متعددة عدسة جامع النظام ، ولكن أيضا ينفذ aspherical عدسة عنصر لتحسين تصحيح الزيغ اللوني في الأشعة تحت الحمراء القريبة والأشعة فوق البنفسجية المناطق . مرشح الحرارة مصممة لإزالة أو قمع الأشعة تحت الحمراء الطول الموجي هو المتصرف في أو بالقرب من الجزء الخلفي من مربع مصباح الإضاءة الرأسية نفسها . وبالإضافة إلى ذلك ، فإن بعض المجاهر تحتوي على نظام مزدوج أو متعدد التردد الإثارة موازن بالقرب من مصباح مربع ( انظر الشكل 4 والشكل 8 ) بشكل انتقائي تصفية موجات الإثارة غير المرغوب فيها من أجل ضبط أداء مجموعة من الفلاتر الفلورية الواردة في الطرف الآخر من الإضاءة .

أيضا بالقرب من مربع مصباح في الإضاءة الرأسية هي مجموعة من مرشحات الكثافة محايدة التي يمكن استخدامها لضبط مجموع كثافة الضوء من خلال النظام والحد من مضان يتلاشى أو photobleaching . . . . . . . هذه الفلاتر هي التي شنت عادة على المنزلق الإطار بحيث يمكن إدراجها بسرعة في مسار الضوء وإزالتها من مسار الضوء مع ملاحظة مضان من العينة . من أجل بناء الإضاءة كوهلر ، الإضاءة الرأسية تتألف من مزيج من وسط الفتحة و مجال الرؤية الفتحة ، وكلاهما متغير الفتحة التي تحدد حجم الحقل و شدة الإضاءة . المحاذاة من الفتحة و الحجاب الحاجز و حجم الفتحة يمكن تعديلها من خلال تعدد أزواج من المقابض المتمركزة على كل من الجانب الخارجي من الإضاءة الرأسية السكن . في بعض التصاميم ، المنزلق مقبض الباب هو المقدمة التي تزيل كامل الفتحة العامة من مسار الضوء إلى زيادة كمية الضوء يمر من خلال الإضاءة . المجاهر الأخرى تحتوي على حجم ثابت من الثقوب ، التي شنت على المنزلق ، والتي يمكن إدراجها في مسار الضوء ، والحد بشكل كبير من مجال الإضاءة ، ومناسبة للتطبيقات الخاصة مثل photobleaching مضان الانتعاش ( FRAP ) المسح .

وراء الحجاب الحاجز الحجاب الحاجز في مجال الإضاءة الرأسية سلسلة البصرية هي عدسة المجال الذي هو ضروري لنشر الضوء وتوليد ما يكفي من مجال الإضاءة لإنشاء كولر الإضاءة . بعد وجود مرآة ، كل حديث عمودي الإضاءة تحتوي على بوابة الضوء ( مع دليل التبديل التحكم ) الذي يمنع ضوء الإثارة القوية من الوصول إلى تصفية مجموعة عينة عندما لا يكون هناك ملاحظة أو تسجيل مضان . مصراع هو سمة أساسية من سمات المجهر الفلورسنت ، لأن التعرض المستمر للعينات يمكن أن تقلل بشكل كبير من الانبعاثات الناجمة عن photobleaching ، في حين أن كثافة الضوء غير صحية على الخلايا الحية . وبالإضافة إلى ذلك ، مصراع يبقى قوس التفريغ مصباح في حالة نشطة ( الحد من وقت التسخين ) ، في حين أن عينة يتم فحصها على الفور مع انتقال الضوء . المجاهر الفلورية عادة ما تكون مجهزة مصراع الالكترونية التي يمكن التحكم عن بعد بسرعة الإضاءة . الأشعة فوق البنفسجية واقية من الغطاء ( المسمى التنفس قناع في الشكل 4 ) هي التي شنت على الجزء الأمامي من السكن الإضاءة لحماية المشغل من التعرض غير مقصود من التعرض للأشعة فوق البنفسجية على الموجات القصيرة التي يمكن أن تكون خطرة عند فتح مصراع الكاميرا .

عدة تصاميم الإضاءة الرأسية توفير فتحات مستطيلة المستقطب الإطار ، والتي يمكن استخدامها لدراسة مضان الاستقطاب . في معظم الحالات ، يتم إدراج المستقطب في مسار الإضاءة خلف المرآة الميدانية ( بعيدا عن المتقارن الطائرة ) ، ولكن قبل ضوء الفرامل ( انظر الشكل 4 ) . المستقطب قد تكون ثابتة في مكان محدد سلفا مع انتقال التوجه أو تركيبه على مجموعة من التروس ، مما يسمح لتغيير اتجاه انتقال رمح باستخدام الاصبع عجلة . منذ المستقطب هي التي شنت في انزلاق الإطار ، يمكن إزالتها بسهولة من مسار الضوء عندما لا تكون قيد الاستعمال . محلل المرفقة ( الثانية المستقطب اللازمة لقياس تباين مضان ) يمكن تركيبها في الإضاءة الرأسية فوق البرج الدوار من تصفية كتلة ، أو في منتصف أنبوب مصممة خصيصا الاستقطاب المجهر . مساعدة الأنابيب عادة ما تكون قادرة على إدراج التناوب التدريجي المستقطب وحدة لضمان دقة تحديد المواقع من محلل انتقال التوجه فيما يتعلق المستقطب و المحور البصري المجهر .

المرحلة التالية من الإضاءة الرأسية يتضمن الجدول الدوارة أو انزلاق قوس ، حيث يتم توفير كتلة البصرية بما في ذلك مجموعة من الفلاتر الفلورية . مرشح كتلة بالتناوب ( أو الشرائح ) في سلسلة البصرية عند الحاجة إلى الجمع بين التصوير باستخدام مرشحات الفلورسنت محددة . . . . . . . كتلة واحدة تحتوي على مجموعة من مطابقة الإثارة و انبعاث مرشحات ، فضلا عن اثنين من لون الطيف ، وكلها وضعت بعناية لزيادة التعرض عينة والتقاط انبعاث مضان من أطوال موجية محددة . كتلة البصرية برج دوار و انزلاق كتلة قوس يمكن تحميلها مع ثلاثة إلى ستة كتل منفصلة ، واحدة في مسار الضوء ، في حين أن غيرها من كتل بالتناوب أو الانزلاق خارج التخزين المؤقت . هذه الملحقات هي قادرة على تحويل بسرعة بين مجموعات من الفلاتر الفلورية عند النظر في عينات المسمى مع اثنين أو أكثر من تحقيقات الفلورسنت . نقل الإضاءة المستخدمة في المجهر مع توفير إضاءة الفلورسنت هو الترويج من قبل كتلة البصرية الافتراضية التي يتم تركيبها في أخدود على طاولة دوارة أو انزلاق كتلة قوس . كتلة الظاهري يمنع انبعاث الإثارة ( عند فتح مصراع الكاميرا ) ، ولكن لا تحتوي على أي مرشح ويسمح للضوء بالمرور من خلال عدسة الهدف دون عائق من عرض أنبوب .

في معيار وحدات المجهر العمودي ، عمودي الإضاءةالمجاهربين الإطار أنبوب المراقبة ( انظر الشكل 1 ) . العديد من الشركات المصنعة توفير أنابيب وسيطة التي يمكن إدراجها بين وحدة الإضاءة والعدسة ، لاستخدامها في المقطب ، مدينة دبي للإنترنت بريزم أو غيرها من الملحقات . إطارات المجهر الحديثة عادة ما تكون نتيجة لجهود التصميم بمساعدة الكمبيوتر ، والتي تؤدي إلى امتصاص الصدمات كبيرة وتعزيز الخصائص الهندسية البشرية . المواد الاصطناعية ، مثل السيراميك والألومنيوم مركّبات المصفوفة المعدنية ، يمكن أن تحسن إلى حد كبير من صلابة ثابتة والحرارة من الإطار ، مما يسمح للأجهزة لتحمل المتطلبات الصارمة لتكنولوجيا مضان المتقدمة ، والتي تتطلب وقتا طويلا * القضاء على الاهتزازات المستخدمة لتصوير انبعاث مضان ضعيفة .

إضاءة المجهر الفلوري كولر

في نيون عمودي الإضاءة ، مصدر الضوء هو وضعه بحيث خيوط أو قوس التفريغ البلازما المجال يقع بالقرب من التركيز الرئيسي من عدسة المكثف . في الإضاءة كوهلر ، عدسة المكثف يلعب دوراً في زيادة كبيرة في مصادر الضوء المساعدة لتعزيز الإضاءة العامة . واحدة من المتطلبات الرئيسية الإضاءة كوهلر هو أن الصورة من خيوط أو قوس يجب أن يكون في نهاية المطاف المتوقعة على الخلفية البؤري عدسة الهدف ، الذي هو أيضا ضعف ( عادة الفتحة العددية العالية ) المكثف خلال الإثارة من الضوء المنعكس . ومن الناحية المثالية ، ينبغي أن يكون مصدر الضوء شغلها مع كامل العدسة الشيئية الفتحة لزيادة كثافة الإشعاع وتوليد مجال موحد من الإشعاع . في بعض الحالات الساخنة ) . ومع ذلك ، منذ نشر مرشح يقلل أيضا من شدة الإضاءة ، ينبغي تجنبها قدر الإمكان .

في الضوء المنعكس كوهلر الإضاءة ( كما هو موضح في الشكل 5 ) ، صورة من مصدر الضوء هو التركيز على الفتحة الحجاب الحاجز في عمودي الإضاءة بواسطة عدسة المكثف . الحجاب الحاجز هو مشترك المتقارن الطائرة مع الفتحة الخلفية من العدسة الشيئية و قوس مصباح أو خيوط ، وبالتالي تحديد حجم الفتحة من تشعيع الميدان . فتحة الحجاب الحاجز من عمودي إضاءة الجهاز و الطائرة البؤرية الخلفية من العدسة الشيئية ( التلميذ ) تشكل مجموعة من الإضاءة المتقارن الطائرة معا . على عكس حالة انتقال المجهر الضوئي ، الفتحة الفتحة و مصدر الضوء يتم تصويرها على السطح الخلفي من العدسة الشيئية ( بمثابة المكثف ) بدلا من وضعه ماديا في هذا الموقف . ميزة إضافية من هذا التكوين هو أن جميع العقبات ، مثل قزحية العين الفتحة ، يتم إزالتها من مسار الضوء عند الهدف عدسة يوفر الإثارة أو تشكيل الصورة من خلال تجميع انبعاث مضان . فتح أو إغلاق فتحة الحجاب الحاجز يستخدم للتحكم في ضوء شارد و ضبط شدة الإضاءة ( الفتحة العددية ) دون تغيير حجم الإضاءة الميدانية . في الصورة ، ضبط الفتحة يؤثر على السطوع والتباين .

التصوير أو مجال مجموعة من المتقارن الطائرة في الإضاءة المنعكسة كوهلر يتكون من حقل الحاجز ، سطح العينة و الصورة المتوسطة الطائرة . وبناء على ذلك ، عندما يتم التركيز على بقعة الحجاب الحاجز في عينة الطائرة ، صورة من مصدر الضوء هو إزالتها بشكل كبير من التركيز على توفير إضاءة موحدة في الميدان . مجال الرؤية الحاجز يتحكم في حجم الحقل المشع دون التأثير على شدة الإضاءة في المنطقة التي يجري النظر فيها . في الممارسة العملية ، ينبغي أن يكون حجم الفتحة الميدانية أصغر قدر ممكن من أجل زيادة التباين في الصورة والحد من photobleaching في المناطق التي لا يمكن ملاحظتها مباشرة . على الرغم من أن كثافة الإضاءة التي تنتجها معظم قوس التفريغ خيوط مصدر الضوء ليست موحدة ، كوهلر الإضاءة يمكن أن تشع مجال العينة بالتساوي . بعد تكوين المجهر بشكل صحيح ، البؤري الخلفي من العدسة الشيئية * يضيء ، وتوفير منطقة مشرقة موحدة من الحافة إلى الحافة . ومن الناحية المثالية ، كوهلر الإضاءة يستحم عينة مع مجموعة متقاربة من الموجات ، كل منها يتكون من نقاط منفصلة على مصدر الضوء ، والتي يتم تصويرها في الفتحة من المكثف . في تصحيح تكوين مجهر فلوري ، والنتيجة هي النقيض من الصورة و القرار . ومن الناحية المثالية ، عينة هو اغتسل مع مجموعة متقاربة من واجهات الموجة ، كل منها يتم إنشاؤها بواسطة نقاط مختلفة على مصدر الضوء الذي يتم تصويره في الفتحة من المكثف . في تصحيح تكوين مجهر فلوري ، والنتيجة هي النقيض من الصورة و القرار . ومن الناحية المثالية ، مجموعة متقاربة من واجهة الموجة المستخدمة في الاستحمام في العينة ، كل منها يتكون منعدسة المكثفالفتحة التي تنتجها نقاط مختلفة على مصدر الضوء . في تصحيح تكوين مجهر فلوري ، والنتيجة هي النقيض من الصورة و القرار .

مصدر الضوء و المنارة

عن التحليل الكمي الدقيق في مضان المجهر ، تشعيع العينة يجب أن تكون ثابتة في الزمان والمكان في جميع أنحاء الميدان . عدم الاستقرار على مر الزمن عادة ما يعكس التقلبات في ضوء الإشعاع الناجم عن التغيرات في انتاج الطاقة . بدلا من ذلك ، الاضطرابات المكانية التي تحدث في كثير من الأحيان في مصابيح القوس تأتي من ما يسمى وميض لأن البلازما كرات تتحرك ذهابا وإيابا على الأقطاب الكهربائية . وميض عادة ما تنتج عن تذبذب التيار الكهربائي ، تغيير طفيف في المقاومة الكهربائية أو الاهتزاز الميكانيكي . خيوط المستندة إلى مصادر الضوء ، مثل مصابيح هالوجين التنغستن شعبية ، هي مستقرة جدا في العمل في ظل حالة من التيار المباشر المستمر باستخدام الجهد استقرار امدادات الطاقة . عادة ، ينبغي اختيار مصدر الضوء من المحتوى الطيفي ، خيوط حجم الاستقرار المكاني والزماني ، والتوحيد في مجال الإضاءة بالمقارنة مع منطقة الفتحة الخلفية من العدسة الشيئية . كثافة مصدر الضوء يجب أن تولي اهتماما خاصا ، لأن الطول الموجي الضيق الذي يمر من خلال الإثارة فلتر يحتوي فقط على جزء صغير جدا من إجمالي الناتج من باعث للضوء .

الاعتبارات الرئيسية في اختيار مصدر الضوء المستخدمة في المجهر مضانالأصباغ الفلوريةو امتصاص الأشعة فوق البنفسجية ذات الطيف المرئي التوزيعات . وبالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون مصادر الضوء متوافقة مع حساسية الكاشف المستخدمة لالتقاط الصور ، سواء كان ذلك في العين البشرية ، الأفلام التقليدية ، مضخم ، تعزيز أنبوب الفيديو ، أو نظام الكاميرا الرقمية . الاختيار يعتمد أيضا على وضع الإضاءة . قوس التفريغ أو التنغستن الهالوجين المصدر يمكن أن تلبي متطلبات مجال واسع مضان المجهر ، المجهر متحد البؤر ومتعدد الفوتون يجب أن تتكيف مع مختلف نظم الليزر . وقد حقق استخدام التنغستن ومصابيح الهالوجين المتوهجة نجاحا محدودا ، لأن معظم انبعاثاتها تحدث في المناطق الحمراء والأشعة تحت الحمراء من الطيف ، في حين أن معظم المجموعات الفلورية متحمس من الأطوال الموجية للأشعة فوق البنفسجية والأزرق والأخضر . وعلاوة على ذلك ، فإن الضوء الناتج من قوس التفريغ مصباح 10 إلى 100 مرة أكثر إشراقا من 12 فولت الكوارتز مصباح هالوجين تستخدم عادة لنقل الضوء . مصدر الضوء الأكثر شعبية في مجال واسع مجهر فلوري هو قوس الزئبق مصباح ، وعادة ما تدرج في النموذج الأساسي المجهر التكوين . وفي بعض الحالات ، تستخدم مصابيح زينون ومصابيح هالوجين معدنية ، ولكن هذه عادة ما تقتصر على الحالات الخاصة التي تكون فيها التوزيعات الطيفية والكثافة مطابقة لمتطلبات مجموعات فلورية معينة .

الزئبق ومصابيح زينون مماثلة في التصميم ، باستثناء الحجم المادي والغاز في السكن لمبة . مصباح الزئبق يتكون من اثنين من أقطاب كهربائية مختومة في زجاج الكوارتز لمبة تحت ضغط عال ، كما يحتوي على بخار الزئبق عنصر . عندما يتم تنشيط الطاقة ، سلسلة من نبضات الجهد العالي يتم إرسالها إلى القطب ، تأين جزء صغير من غاز الزئبق و إشعال المصباح . بعد اطلاق النار ، والجهد هو انخفاض الغاز المتأين يستخدم لتحمل الحالية وتوليد البلازما الكرة شكلت بين اثنين من أقطاب كهربائية . أثناء تشغيل المصباح ، يتبخر الزئبق داخل لمبة زجاجية لتوليد كمية كبيرة من الحرارة والضغط ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى إنتاج ضوء عالي الكثافة . مصابيح قوس الزئبق تنتج الضوء المستمر حتى في نطاق الأشعة فوق البنفسجية المرئية ، تتركز في 365 , 400 , 440 , 546 و 580 نانومتر منفصلة الطول الموجي . من الأشعة فوق البنفسجية إلى الأشعة تحت الحمراء ، مصابيح زينون أكثر كثافة موحدة التوزيع في جميع أنحاء الطيف . اختيار الأصباغ الفلورية مهم جدا في تحديد مصدر الضوء المناسب من مضان المجهر . بعض تحقيقات الفلورسنت قد الإثارة العصابات التي تتزامن مع أبرز خطوط الزئبق ، في حين أن غيرها من تحقيقات الفلورسنت الاستفادة من توزيع أكثر تجانسا من التعرض لمصابيح زينون .

المحاذاة الصحيحة من قوس مصباح في المجهر الفلوري أمر بالغ الأهمية لتحقيق الإضاءة كولر وتجنب المناطق المظلمة من الصور الفلورية . وبناء على ذلك ، يمكن الحكم على نوعية مصباح مربع عموما من خلال استقرار محاذاة مصباح الصحيح وكفاءة ضبط مقبض الباب للحفاظ على محاذاة . حامل المصباح يجب أن تكون مجهزة مع مصباح تتمحور مسامير بحيث تتمحور الصورة المقوسة في الفتحة الخلفية من العدسة الشيئية ، مصباح مربع يجب أن تحتوي على فلتر الأشعة تحت الحمراء لمنع أطوال موجية طويلة في الحمراء البعيدة والأشعة تحت الحمراء ، وبالتالي توليد كمية كبيرة من الحرارة . بعض صناديق مصباح مصممة مع المدمج في قمع الأحمر مرشحات ( على سبيل المثال ، شوت bg38 ) أو فتحات لهذا النوع من مرشحات لإزالة الخلفية الحمراء التي ينظر إليها من خلال عرض في بعض التطبيقات . وبالإضافة إلى ذلك ، لا ينبغي أن تسرب ضوء مربع الضارة الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية في حد ذاته ، ويفضل أن يكون ذلك ، إذا كان السكن هو تحول عن غير قصد أثناء العملية ، يجب أن تشمل التبديل تلقائيا إيقاف الضوء . يجب أن تكون قوية بما يكفي لتحمل احتمال انفجار الموقد أثناء العملية .

مجموعة واسعة من تطبيقات المجهر الفلوري عادة ما تتطلب سلسلة من مصادر الضوء لتلبية متطلبات محددة من المجموعات الفلورية والتصوير الظروف . في بعض الحالات ، مزيج مع نظام الكاميرا فائقة الحساسية قد تتطلب مستويات منخفضة جدا من الإشعاع ، في حين أن دراسات أخرى قد تتطلب كثافة الليزر الإثارة لقتل الخلايا الحية أو انتقائية تبييض فوسفورات . الطول الموجي يتطلب عادة عبر كامل المنطقة المرئية من الطيف ، فضلا عن أجزاء من الأشعة فوق البنفسجية والأشعة تحت الحمراء . لأن مصدر ضوء واحد لا يمكن تلبية هذه الاحتياجات الإضاءة متعددة ، محول قدمتها الشركة المصنعة الآن يمكن ربط اثنين أو أكثر من مصابيح المجهر واحد في وقت واحد .

الجمع بين فلتر الفلورسنت

كما ذكر من قبل ، ضوء يمر من خلال العدسة و الحجاب الحاجز من عمودي الإضاءة في نهاية المطاف تواجه الإثارة فلتر الواردة في كتلة البصرية التي يتم وضعها في تتزامن مع محوري تقاطع بين مسار الضوء من الإضاءة و المجهر الضوئي . الإثارة مرشح يختار الضيق الطول الموجي من مجموعة واسعة من الطيف المتولد من مصباح وينقل لهم إلى اثنين من المرايا اللونية التي تعكس الضوء من خلال عدسة الهدف و تشع على العينة . قبل تشكيل الصورة في العدسة الثابتة الحاجز ، مضان الانبعاثات التي تم جمعها من خلال عدسة الهدف يمر من خلال عدسة ديتشرويسم و انبعاث أو حاجز فلتر . الفلاتر المستخدمة عادة لفصل الموجات في مجال واسع المجاهر الفلورية تشمل الزجاج الملون فلتر و تدخل رقيقة فلتر ( أو مزيج من الاثنين ) . تحديد مرشح مناسب لكل خطوة في الإضاءة والتصوير المجهري مضان السيناريو يمكن أن يسبب الارتباك ، لأن عددا كبيرا من الشركات المصنعة فلتر ، كل منها يوفر الملكية أبجدية تسميات الفلورسنت الأدب .

ويبين الشكل 7 نموذجيالإثارة مضان كتلةالهياكل التشريحية ، فضلا عن ارتباط الأطياف ملامح ديتشرويسم ، الإثارة و حاجز مرشحات . تصفية كتل عادة ما يتم تجميعها من قبل أدوات مخصصة قدمتها الشركة المصنعة ، بحيث يمكن للمشغل تبادل مرشحات ومرآة اللونين . الإثارة و حاجز الفلاتر هي ثابتة في مكان من خلال الاحتفاظ كليب ، البصرية الغراء أو جولة المسمار جبل ( انظر الشكل 7 ) . عادة ، هذه الفلاتر يمكن إزالتها دون فتح القطع البصرية ، لأنها تقع فوق راحة الثقوب على السطح الخارجي المسطح . استبدال اثنين من لون المرآة هو أكثر صعوبة ، تحتاج إلى إزالة كتلة للوصول إلى الداخل . معظم أجزاء من كتلة مصنوعة من 45 درجة قطري مشترك ، من خلال حماية الداخلية ودعم مرآة اللونين بزاوية مناسبة ، يمكن تحقيق المهام المزدوجة . بعد إزالة السحابات ( دبابيس أو مسامير صغيرة ) تأمين أجزاء من كتلة معا ، مرآة يمكن إزالتها عن طريق فك أو تحريك الاحتفاظ كليب بعناية إزالتها من كتلة . مرآة اللونين ينبغي التعامل معها بعناية لأن تدخل الطلاء عادة ما تكون غير محمية و خدش بسهولة . توريد العديد من الشركات المصنعة فلتر المجهر كما تقدم مجموعة متنوعة من مرشحات ما بعد البيع ومرآة اللونين ، ومناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات الفلورسنت . بعد إزالة السحابات ( دبابيس أو مسامير صغيرة ) تأمين أجزاء من كتلة معا ، مرآة يمكن إزالتها عن طريق فك أو تحريك الاحتفاظ كليب بعناية إزالتها من كتلة . مرآة اللونين ينبغي التعامل معها بعناية لأن تدخل الطلاء عادة ما تكون غير محمية و خدش بسهولة . توريد العديد من الشركات المصنعة فلتر المجهر كما تقدم مجموعة متنوعة من مرشحات ما بعد البيع ومرآة اللونين ، ومناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات الفلورسنت . بعد إزالة السحابات ( دبابيس أو مسامير صغيرة ) تأمين أجزاء من كتلة معا ، مرآة يمكن إزالتها عن طريق فك أو تحريك الاحتفاظ كليب بعناية إزالتها من كتلة . مرآة اللونين ينبغي التعامل معها بعناية لأن تدخل الطلاء عادة ما تكون غير محمية و خدش بسهولة . توريد العديد من الشركات المصنعة فلتر المجهر كما تقدم مجموعة متنوعة من مرشحات ما بعد البيع ومرآة اللونين ، ومناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات الفلورسنت .

مرشحات الفلورسنت مصممة تشمل تمرير طويلة ، قصيرة تمرير ( حافة مرشحات ) ، والضيق ، متوسطة ، واسعة النطاق مرشحات . الأطياف في الشكل 7 تظهر بعض الأمثلة الشائعة تصفية ملامح . طيف الانبعاث فلتر ( الأزرق منحنى ) في الشكل 7 يتم إنشاؤها بواسطة ممر طويل تدخل فلتر مع قطع الطول الموجي حوالي 575 نانومتر . أطوال موجية أطول تنتقل عن طريق الفلاتر ، في حين أن أقصر أطوال موجية منعت . الضيق ممر الموجة مرشحات الإثارة ( الأحمر المنحنيات ، الشكل 7 ) من نفس المجموعة لديها عرض النطاق الترددي حوالي 20 نانومتر ، في حين أن اثنين من لون مرآة ( الأخضر المنحنيات ) قد يحيل بها مناطق متوسطة تقريبا ( 455-490 نانومتر ) واسعة النطاق ممر الموجة مرشحات ( 560-775 نانومتر ) . لأن اثنين من لون المرايا هي فعالة مثل مرشحات تمرير طويل في الأخضر ، الأصفر والأحمر مناطق الطيف المرئي ( 560 إلى 700 نانومتر ) يتم معالجتها في تصفية البنوك . معرفة كيفية الاستفادة من امتصاص وانبعاث أطياف الفلورية لتحديد مجموعة مناسبة من فلاتر المجهر الفلوري

ثنائي اللون مرآة ( أو شعاع الفاصل ) هو عنصر أساسي في مزيج من مرشحات المجهر الفلوري ، على غرار التدخل مرشح تمرير طويل ، والتي يتم تصنيعها مع التسامح متعدد الطبقات مواد عازلة . الفرق الرئيسي بين اثنين من المرايا اللونية ومعيار تدخل مرشحات هو أن المرايا مصممة خصيصا للتفكير ونقل في حدود محددة الطول الموجي ، ويجب أن تعمل بزاوية 45 درجة بالنسبة إلى المحور البصري من المجهر و luminophor . . . . . . . ثنائي اللون مرآة هو وضعه بحيث تدخل طبقة تواجه مصدر الضوء بحيث تعكس الإثارة قصيرة الطول الموجي إلى عينة في زاوية 90 درجة من خلال النظام البصري . نفس المرآة يجب أن تكون بمثابة انتقال مرشح لنقل طويلة الطول الموجي مضان الانبعاثات من العدسة الشيئية إلى صورة الطائرة . لأن الطول الموجي انتقال المنطقة بين الانعكاس الكلي تقريبا و انتقال كبير عادة ما تقتصر على 20 أو 30 نانومتر ، ثنائي اللون مرآة يمكن أن تميز بدقة الإثارة والانبعاثات من الأطوال الموجية .

مجموعة من الفلاتر الفلورية مصممة لتتناسب مع الطول الموجي الإثارة محددة تعكس المنطقة في اللون مرآة . والنتيجة هي أن الضوء المنعكس على عينة من خلال المجهر . انبعاث مضان من العينة يجب أن تكون مطابقة مع انتقال عالية من المناطق في مرآة ديتشرويسم لتمكين هذه الأطوال الموجية لتمرير من خلال الكاشف . حاجز الفلاتر ليست مهمة جدا في النظام برمته ، ولكن لا تزال تلعب دورا هاما في ضمان القضاء على الإثارة الطول الموجي التشتت والانعكاس ، ومضان من تحقيقات خارج الهدف العام كثافة الخلفية بسبب تألق ذاتي . عامل مهم في إنشاء بنك التصفية هو التأكد من أن انتقال ، والتفكير ، منحنى الانبعاثات من مرشح يطابق منحنى الانبعاثات من المنطقة المقابلة . خلاف ذلك ، الإثارة الطول الموجي يمكن أن تمر من خلال مرآة اللونين و طمس الصورة ، أو انبعاث مضان قد تعكس عن غير قصد في المرآة تلف سطوع الصورة .

حتى في ما يبدو مثاليا مطابقة مرشحات ، تداخل طفيف بين التوزيعات الطيفية من كل مرشح يمكن أن تحدث ، مما يقلل من الأداء . ومن المثير للاهتمام بصفة خاصة هو الحديث المتبادل بين الإثارة فلتر ومرآة ديتشرويسم ، مما يسمح لبعض الضوء المنبعث لتمرير من خلال مرآة تعكس من جدار مرشح كتلة . كما ذكر أعلاه ، الضوء المنعكس في زاوية ميل عالية يمكن أن تنتقل جزئيا من خلال حاجز فلتر للحد من التباين في الصورة . هذا النوع من التسرب من خلال فلتر يسمى الاختراق أو العبور ، في الواقع جميع تركيبات فلتر يحدث أكثر أو أقل . واحدة من المجالات الرئيسية التي تهم الشركات المصنعة فلتر المجهر هو تحسين تصميم مزيج من الفلاتر الفلورية للحد من عبور المستويات .

العديد من التشكيلات من الفلاتر الفلورية المجموعة المبينة في الشكل 8 . مرشح كتلة برج ( الشكل 8 ( أ ) ) يتكون من خمس كتل التي يمكن تحويلها بسرعة بين مرشح مجموعات ، في حين أن ما لا يقل عن هذا العدد من المجموعات الفلورية هو درس . واحدة من فتحات البرج عادة ما تكون مليئة كتل بصرية افتراضية أو فارغة لنقل الضوء . الإثارة الطيف هو تقليم باستخدام الإثارة الموازن ( الشكل 8 ( ب ) ) إلى صورة مزدوجة أو متعددة المسمى عينة ، بما في ذلك واحدة تدخل مرشح شنت على دوار المشتركة . ضبط قضيب من الإثارة موازن بالتناوب يتحرك ممر الموجة انتقال المنطقة من مرشح بصري إلى أقصر من الطول الموجي . وبناء على ذلك ، عندما موازن فلتر تدور من الصفر زاوية السقوط ( عمودي على محور عمودي الإضاءة ) إلى زاوية دوران كبيرة 45 درجة ، ممر الموجة المنطقة من فلتر يمكن نقلها بين 25 و 50 نانومتر . الإثارة الموازن يمكن استخدامها منفردة أو في سلسلة لتغيير عرض النطاق الترددي الإثارة لاحظ صبغة الفلورسنت بحيث كثافة الانبعاثات على قدم المساواة . هذه الميزة تمكن من ضبط كثافة مضان مجموعة في عينة تحتوي على عدة تحقيقات ، على سبيل المثال ، والحد من انبعاث مضان من التحقيق مع زيادة كثافة التحقيق الأخرى . الإثارة الموازن يمكن استخدامها منفردة أو في سلسلة لتغيير عرض النطاق الترددي الإثارة لاحظ صبغة الفلورسنت بحيث كثافة الانبعاثات على قدم المساواة . هذه الميزة تمكن من ضبط كثافة مضان مجموعة في عينة تحتوي على عدة تحقيقات ، على سبيل المثال ، والحد من انبعاث مضان من التحقيق مع زيادة كثافة التحقيق الأخرى . الإثارة الموازن يمكن استخدامها منفردة أو في سلسلة لتغيير عرض النطاق الترددي الإثارة لاحظ صبغة الفلورسنت بحيث كثافة الانبعاثات على قدم المساواة . هذه الميزة تمكن من ضبط كثافة مضان مجموعة في عينة تحتوي على عدة تحقيقات ، على سبيل المثال ، والحد من انبعاث مضان من التحقيق مع زيادة كثافة التحقيق الأخرى .

التطور السريع في تكنولوجيا الطلاء رقيقة يمكن أن يكون ثبت من خلال القدرة على توليد العديد من انتقال القمم في واحد تدخل فلتر ، والقدرة على إنتاج متداخلة تعكس انتقال العصابات في اثنين من لون المرايا . عند مطابقة بشكل صحيح ، يمكن الجمع بين اثنين من الفرقة مرشحات لونين لإنتاج عدد وافر من مجموعات تصفية الفلورسنت التي يمكن أن تثير في وقت واحد ومراقبة الانبعاثات من عدة مجموعات الفلورسنت . تصفية مجموعات يمكن الحصول عليها من الشركة المصنعة ، ومناسبة لاثنين أو ثلاثة أو حتى أربعة fluorophores في نفس العينة . المشكلة الرئيسية مع عدد وافر من تصفية البنوك هو التكلفة الزائدة عبر أو اختراق يحدث عند انبعاث من مسبار الفلورسنت يمر عبر منطقة ممر الموجة المستخدمة في آخر . في بعض العينات ( تصفية مجموعات ) ، تسلل له تأثير كبير على كثافة الخلفية وعلى النقيض من الصورة . العديد من الباحثين يميلون إلى استخدام مرشحات الأمثل لتصوير كل مجموعة على حدة ، ثم الجمع بين الصور في المجمعات .

مضان التكنولوجيا المتقدمة عادة ما يتطلب استخدام العديد من الإثارة و انبعاث مرشحات مع واحد ديتشرويسم . . . . . . . ولتسهيل هذه الدراسات ، تم تجهيز العديد من المجاهر الفلورية بمرشحات كهربائية أو بمرشحات منزلقة ، بما في ذلك ستة مرشحات منفصلة ( انظر الشكل 8 ( ج ) ) . المجهر مصممة للاستخدام مع المنزلق قد تحتوي على فتحة خاصة لإدراج المنزلق في الإضاءة الرأسية ، أو مرشح المنزلق قد تحل محل المنزلق التي عادة ما تحتوي على كثافة محايدة فلتر . في بعض التصاميم المجهر ، عمودي luminophor قد تحتوي أيضا على انبعاث المنزلق ، أو مساعدة أنبوب الأوسط التي شنت بين luminophor ومراقبة أنبوب لاستيعاب المنزلق . في رأسي و مقلوب المجهر ، فلتر كهربائي وحدة بما في ذلك الإثارة فلتر يقع عادة في مسار بصري عمودي الإضاءة بين كثافة محايدة فلتر مصباح مربع . وبالمثل ، فإن الانبعاثات الكهربائية وحدة تصفية هو التخلص من بين الإضاءة العمودية و العين أنبوب المراقبة في تصميم المجهر العمودي ، ولكن عادة ما تكون متصلا من خلال نفس المنفذ الخارجي للكشف عن عكس الصك . الإثارة والانبعاثات المنزلق الكهربائية تصفية عجلة هي مفيدة جدا في كل من ثنائي و ثلاثي الإثارة التطبيقات التي تستخدم واحدة مزدوجة اللون مرآة . من خلال القضاء على الحاجة إلى إعادة توجيه مرشح كتلة عند النظر في عينة واحدة ، هذه الملحقات تمكن الباحث من الحصول على دقة التسجيل بين الصور .

الهدف من المجهر مضان

في جميع أشكال الضوء المنعكس المجهر ( بما في ذلك مضان ) ، كثافة الصورة هي وظيفة من الفتحة العددية و تكبير العدسة الشيئية . في الواقع ، كثافة أو سطوع ( يعرف بأنه تدفق الفوتون في وحدة المساحة والوقت ) يزيد من حجم الفتحة العددية من الدرجة الرابعة ، ولكن فقط يتناسب عكسيا مع مربع من التضخيم :

قوة ألفا ( NAOBJ ) 4 / م 2

نه هو الفتحة العددية و م هو التكبير . من هذه العلاقة ، يمكننا أن نرى بوضوح أن مشرق مضان الصورة تتكون منالفتحة العدديةو انخفاض التكبير ( على سبيل المثال ، 0.75 / 20x ) . على سبيل المثال ، 60x-programmed الوني النفط مغمورة عدسة الهدف مع الفتحة العددية 1-4 نظريا تنتج صورة أكثر إشراقا من 100 مرة من نفس الفتحة العددية عدسة الهدف ، ولكن المفاضلة يجب النظر فيها . زيادة عدد عناصر العدسة الداخلية ( مثل العدسة الشيئية ذات الفتحة العددية العالية ) يؤدي إلى زيادة في مضان عفوي و انخفاض في قوة التفكير من سطح العدسة الداخلية . في كثير من الأحيان ، والمصنعين جعل المفاضلة بين العوامل الإيجابية الكلية وزيادة انتقال الضوء في المجهر الفلورسنت عدسة الهدف الموصى بها .

في العام ، وارتفاع الفتحة العددية النفط ( 1-3 إلى 1-4 ) و الماء ( 1-2 ) مغمورة في مخطط فلوريت و مستو متعدد الوني الهدف لإنتاج صور الفلورسنت مشرق بسبب قدرة كبيرة على التركيز . هذه العدسات الشيئية تظهر ممتازة تصحيح الألوان ، وبالتالي قادرة على التركيز على مجموعة متنوعة من الأطوال الموجية الانبعاثات الفلورية في نفس الطائرة . إن retrochromatism و نفاذية الضوء من فلوريت عدسة الهدف * في انخفاض إلى حوالي 350 نانومتر ، وهو شرط للتحقق من الأصباغ الفلورية ( على سبيل المثال ، دابي ، هويشت ، اليكسا floor-350 ، AMC ) متحمس في الأشعة فوق البنفسجية في المنطقة . على الرغم من أن هناك العديد من العدسات الداخلية ، هذه العدسات الهدف مصنوعة من الزجاج مع انخفاض الفلورية المضادة للانعكاس طلاء للحد من مضان الخلفية وتوليد عالية جدا على النقيض من الصور .

الهدف العدسات المصممة خصيصا للتطبيقات الخاصة تستخدم على نطاق واسع في مضان المجهر . وتشمل هذه الفئة غمر المياه ذات الفتحة العددية العالية ، غمر متعددة ( النفط والمياه والجلسرين ) ، والأشعة فوق البنفسجية عدسة الهدف مع عدسة الكوارتز عنصر . في خلية حية تطبيقات التصوير ، عدسة الهدف بعد فترة طويلة من العمل مع تصحيح حلقة مطلوب لمراقبة عينة من خلال ثقافة سميكة ( 0.5-2 ملم ) جدار الزجاجة . من خلال تسهيل التفتيش على عمق العينة سميكة من العدسات الشيئية مع أطوال بؤرية طويلة جدا ( مسافة العمل ) ، هذه العدسات الشيئية يمكن الحصول عليها من العديد من الشركات المصنعة للتصوير من خلال تغطية النظارات مع الهواء أو الماء . طويل المدى غمر المياه عدسة الهدف مصممة للاستخدام دون تغطية الزجاج أيضا تفتق الجبهة تفلون ، بحيث يمكن غمر عدسة الهدف في محلول مائي . عدسة الهدف مماثلة يتم إنشاؤها بواسطة الأشعة فوق البنفسجية الإثارة ( 340 نانومتر ) في الماء على مسافة التشغيل من 20 إلى 30 ملم ( بما في ذلك حوالي 5 ملم من الماء ) . انخفاض نسبي في التكبير ، 20 مرة غمر عدسة الهدف مع * الفتحة العددية ( 0.75 إلى 0.95 ) هو الموصى به . على الرغم من أنها مكلفة للغاية ، هذه العدسات تنتج صورة مشرقة للغاية مع انخفاض تركيز الفوسفور و / أو الكم العائد .

تركيبات المجهر الفلورسنت

الشركات المصنعة باستمرار إنتاج وحدات الملحقات الإضافية مفيدة لأجهزتها ، من أجل زيادة الخيارات المتاحة في تطبيقات التصوير المجهري مضان المتنامية . على سبيل المثال ، في بعض المجاهر ، مستطيلة الحجاب الحاجز يمكن اختيارها ( انظر الشكل 9 ) ، والتي يمكن أن تحد من منطقة العينة المشع لزيادة التباين والحد من photobleaching . . . . . . . وحدات في الموقع بدلا من الحجاب الحاجز الحجاب الحاجز التقليدية ( انفصال وحدة ) في الإضاءة الرأسية ، مصممة لتتناسب مع نسبة الارتفاع من التصوير الرقمي الاستشعار . المستطيل توقف يحسن كفاءة الإضاءة كولر ويقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء من أجهزة الاستشعار الالكترونية . كما ميزة إضافية ، عند استخدام برمجة مرحلة المسح الضوئي في deconvolution البحث ، حجم المستطيل من الصورة يمكن تعديلها لتتناسب مع حجم الخطوة من المرحلة . ثقب الدبوس هو مماثلة لتلك التي من حقل مستطيل الحجاب الحاجز ، ويمكن استخدامها في التطبيقات التي تتطلب درجة عالية من الإضاءة المحدودة في الميدان .

الملحقات الأخرى تشمل السكن مصباح مزدوج محول التي تمكن اثنين من مصادر الضوء ( مثل الزئبق و مصابيح زينون قوس التفريغ ) أن تكون متصلا في وقت واحد إلى عمودي الإضاءة . فائدة نموذج مناسبة لأنّ إنارة الليزر الإثارة ، ويمكن أيضا أن تستخدم في الانعكاس الكلي الداخلي مضان ( tirf ) ، مضان عمر التصوير المجهر ( فليم ) ، نسبة التصوير و photobleaching استعادة التجربة . وبالإضافة إلى ذلك ، تقدم الشركات المصنعة الرئيسية معظم المجاهر الفلورية الصف البحوث التي تناسب بسهولة مع كل من ليزر متحد البؤر المسح زينة . المجهر تستقيم يستقبل متحد البؤر المسح الضوئي وحدة من خلال عرض ثلاثي أنبوب ، في حين أن جهاز مقلوب يربط شعاع الماسح الضوئي إلى جانب أو الخلفي ميناء المجهر الإطار . اثنين من الموانئ التي يتم إدراجها بين عمودي الإضاءة أنبوب العرض يمكن استخدامها لإدخال مصدر ضوء إضافي أو توجيه مضان إلى أكثر من كاشف . معظم هذه الأجهزة تأتي مع اختياري ج نوع تركيب محول أو معيار المجهر ميناء الملحقات .

مجهر فلوري ، مصممة لدراسة الكهربية ، أصبحت معقدة جدا . وقد تم تجهيز العديد من مع مستويات امتصاص الصدمات المتخصصة التي يمكن أن تقبل مجموعة متنوعة من الملحقات micromanipulator لاستخدامها في التجارب مع مضان ، الأشعة تحت الحمراء ( الأشعة تحت الحمراء النقيض من التدخل التفاضلية ir-dic ) والتقليدية في مجال تعزيز النقيض من تقنيات التصوير . تناوب القرص من الحيوان مرآة يمكن تحقيق سريع غير الاهتزاز تبادل عدسة الهدف ، وبالتالي منع تدخل عينة أو فقاعة الهواء أثناء التصوير من الخلايا الحية والأنسجة . مضان العيانية الملاحظة في الكائنات الحية يمكن أن يؤديها باستخدام جديدة عالية الفتحة العددية ، تعمل مسافة طويلة 2x و 4x عدسات الماكرو ( الهدف العدسات ) التي يتم توفيرها مع فلتر خاص الجمع بين كتل . وبالإضافة إلى ذلك ، العديد من الشركات المصنعة أيضا توفير الإضاءة الفلورية العمودية وتصفية مجموعات كمرفقات المجاهر المجسمة .

عمودي الإضاءة في بعض الأحيان يمكن أن تختار من 1.25 إلى 1.5 مرة من معامل التضخيم كخيار ، ولكن بسبب المشاكل المتأصلة في عرض فارغة التضخيم ، ينبغي تجنب استخدام عدسة مساعدة في الصورة الفلورية . العديد من وحدات الإضاءة الرأسية مصممة تشمل وسائل ربط الخائن وحدة تعدد منافذ الكاميرا الواردة فوق الإضاءة لزيادة القدرة على التصوير . مع الأخذ في الاعتبار الآن مجموعة متنوعة من الملحقات الكهربائية المستخدمة في المجهر الفلورسنت ، بما في ذلك القرص الدوار عدسة الهدف ، المكثف ، مرشح عجلة ومنصة ، يمكن للباحثين الحصول على تقنيات التصوير أكثر تعقيدا من أي وقت مضى . الشركات المصنعة قد استثمرت قدرا كبيرا من الجهد في تصميم أجزاء من العديد من التطبيقات المعقدة التي تستخدم مرة واحدة فقط * قطعة المجهر من مصادر مختلفة . مع تطور علم الأحياء الخلوي ، neurophysiology والسريرية مجالات المجهر الفلورسنت أصبحت أكثر وأكثر أهمية .

تصميم مجهر فلوري مقلوب

إصدارات مماثلة من الإضاءة الفلورية العمودية يمكن استخدامها لعكس ( زراعة الأنسجة ) المجهر السقالات . عكس الدعامات تسمح أيضا مزيج أو التناوب بين مختلف تقنيات تعزيز النقيض من الضوء المنعكس مضان و انتقال المجهر الضوئي . دراسة المجهر المقلوب متعددة ( أكثر من ستة ) المدخلات / المخرجات الموانئ ، وعادة ما يكون ميناء واحد على كل جانب من الإطار ، واحد أو اثنين من الموانئ في الجزء الخلفي ( العلوي والسفلي ) والجزء السفلي من أسفل ميناء المجهر في بعض النماذج ، يمكن الحصول على الصورة الرئيسية في وقت واحد من ثلاثة أو أكثر من الموانئ ، دون الحاجة إلى استخدام عدسة التتابع . هذا المستوى من الاتصال يجعل من الممكن إجراء تحليل مضان معقدة باستخدام مصادر الضوء متعددة ، تصفية عجلات الكاميرا النظم . الزئبق و زنون عاكس الضوء على المجهر المقلوب يمكن استخدامها مع معيار متعدد العناصر أو aspherical عدسة المكثف لتحسين الأداء والحد من الانحرافات في الأشعة فوق البنفسجية والأشعة تحت الحمراء الطيفية المناطق . وبالإضافة إلى ذلك ، مجموعة متنوعة من مربع مصباح محولات يمكن استخدامها لربط تعدد مصادر الإضاءة ، على غرار الملحقات التي يمكن استخدامها في المجهر العمودي .

ويبين الشكل 10 صورة حديثة مقلوب ( زراعة الأنسجة ) مجهر فلوري مجهز بلتيير تبريد اتفاقية مكافحة التصحر صورة الاستشعار التقليدية 35 ملم فيلم الكاميرا . على الرغم من الفيلمالكاميراتومع ذلك ، فإن معظم المجاهر المقلوبة لا تزال في الجزء السفلي من القاعدة الأمامية بما في ذلك الموانئ لهذه الملحقات . المجاهر المبينة في الشكل 10 يمكن أن تؤدي الإضاءة التقليدية ( مع أو بدون تعزيز النقيض ) باستخدام التنغستن هالوجين مصباح مربع شنت على عمود . مصابيح الزئبق أو زينون قوس التفريغ المستخدمة في المجاهر الفلورية ، وذلك باستخدام الإضاءة العاكسة التي تعلق على منفذ خلفي مشكل خصيصا . الفتحة و مجال الفتحة ، فضلا عن كثافة محايدة فلتر ، تدخل بالقرب من ميناء في الجزء الخلفي من المجهر . في بعض نماذج المجهر المقلوب ( لا تظهر ) ل على شكل عاكس الضوء بما في ذلك توسيط الفواصل يمكن استخدامها لتحسين الوصول إلى منفذ الثانوية الخلفي ملحق . في الشكل 10 ، مسار الضوء من خلال المجهر يمثل انتقال الضوء الأصفر ، الأرجواني يشير إلى تصفية قوس مصباح الإضاءة ، الأخضر يشير إلى الإثارة مضان من تصفية الضوء الأحمر يشير إلى انبعاث مضان .

الحديثة في إطار المجهر المقلوب ، مثل نظيراتها تستقيم ، هي المواد المركبة التي تم تصميمها وتصنيعها من قبل أجهزة الكمبيوتر المستخدمة في البناء والاستقرار الحراري . وعلاوة على ذلك ، فإن منصة الميكانيكية مكونات الدائرة تصميم هيكل لديه السكتة الدماغية قصيرة المدى وعالية الصلابة لتجنب نصب والانحراف عند التعامل مع عدسة الهدف والعتاد التوجيهية في العمليات التقليدية مثل مدينة دبي للإنترنت موشور إدراج أو تعديل عدسة الهدف تصحيح خاتم . مرحلة متقدمة من عدسة الهدف الدوار الإطار يمكن القضاء على التركيز الانجراف في تأخير الوقت الطويل مضان المراقبة . مرحلة أخرى من الخيارات التي لا تتوفر على مستوى عمودي المجاهر تشمل انزلاق و 360 درجة التناوب المرحلة ، مرحلة الزجاج إدراج لوحة ، لوحة التدفئة ، طبق الثقافة ، لوحة قوس ، فضلا عن ثاني أكسيد الكربون حاضنة .

مع تصميم وحدات المجهر المقلوب يمكن تهيئتها بسهولة لاستخدامها في الكهربية ، والتخصيب في المختبر ، والتلاعب المجهري ، وارتفاع القرار مدينة دبي للإنترنت ، وتعزيز المراقبة بالفيديو والبحوث في مختلف التقنيات الفلورية المتقدمة . هذه الأدوات هي أيضا من السهل أن تنطبق على البؤر و multiphoton المجهر . وتشمل الملحقات الكهربائية مصراع ، عجلة تصفية ، عدسة دوارة القرص الدوار ، مضان كتلة القرص الدوار ، والتركيز على السائق و المكثف . عندما جنبا إلى جنب مع مجموعة عالية ، غمر المياه ، والأشعة فوق البنفسجية الإثارة و المرحلة النقيض من ذلك ، جميع العدسات البصرية عالية التصحيح ، المجهر المقلوب هو أداة مثالية لدراسة مضان من الخلايا الحية والأنسجة .

الاستنتاج

في مضان المجهر ، مجموعة واسعة من التغيرات في تركيز المجموعات الفلورية المحلية في العينة ، بالإضافة إلى الاختلافات في معامل الخمود و الكم العائد من الأصباغ الفلورية من نوع واحد إلى آخر ، تؤثر بشكل كبير على انبعاث إشارة إلى إعطاء كمية من الإثارة . وبالنظر إلى أن العديد من العينات تحتوي فقط على كميات صغيرة من المواد الفلورية في أي مجال الرؤية ، متوسط مستويات انبعاث مضان من هذه العوامل مجتمعة هي 4 إلى 6 أوامر من حجم أصغر من كثافة الإثارة . . . وبالإضافة إلى ذلك ، هناك بعض التقنيات الأكثر تعقيدا مضان ، مثل التهجين في الموقع و الرنين نقل الطاقة ( الحنق ) ، التي يمكن أن تنبعث منها إشارة قوة 9 إلى 10 أوامر من حجم أصغر من الإثارة . للتعويض عن هذه الاختلافات الكبيرة بين شدة الإثارة والانبعاثات ، المجاهر الفلورية الحديثة يجب أن تكون قادرة على تخفيف الإثارة التشعيع أكثر من مليار مرة دون التدخل مع إشارات الفلورسنت .

واحدة من السمات الرئيسية مجهر فلوري هو خصوصية عالية من مسبار فلوريسنت لامتصاص الضوء المنبعث من الطول الموجي مميزة ، مما يجعل من الممكن الكشف عن الأنواع المستهدفة بشكل انتقائي في تركيزات منخفضة جدا في خليط معقد . وعلاوة على ذلك ، فإن حساسية عالية و القرار المكانية من مضان يسمح لتحديد المواقع بدقة ودراسة الجزيئات الفردية على مقياس طولي أقل من القرار البصرية المجهر . كما أن العوامل البيئية المحلية تؤثر تأثيرا خطيرا على انبعاث مضان ، لذلك الأسلوب هو التحقيق المثالي الحموضة ، اللزوجة ، تركيز أيون ، والمسافة الجزيئية والتوجه ، غشاء المحتملة ، hydrophobicity وتوزيع الشحنة الكهربائية و معامل انتشار التقلبات . وقت القرار من مضان يقتصر على عمر مسبار الفلورسنت متحمس ، والتي يمكن أن تكون النانوسيكند . منذ العديد من العمليات البيولوجية تحدث في هذا المجال الزمني ، تسوس حركية يمكن أن تكشف عن معلومات حيوية عن العمليات الخلوية . وعموما ، فإن هذه العوامل تلعب دورا هاما في تطبيق المجهري مضان في بيولوجيا الخلية .

على مدى العقد الماضي ، المجاهر الفلورية قد نمت بمعدل ينذر بالخطر ، وكذلك في تكنولوجيا الليزر ، الحالة الصلبة للكشف عن التداخل رقيقة تصنيع الكمبيوتر المستندة إلى تحليل الصور . تطوير عالية الفتحة العددية غمر المياه عدسة الهدف يمكن أن تساعد في دراسة الظواهر البيولوجية ، مما يجعل من الممكن للباحثين للكشف عن الخلايا الحية في البيئة الطبيعية . كما مصنعين المجهر الاستجابة للاحتياجات المتغيرة في مجال البحوث ، وتطوير أدوات الفلورسنت المتقدمة والاكسسوارات لا شك سوف تستمر في النمو ، والتي قد تكون ذات أهمية كبيرة في نهاية المطاف إلى استكشاف سر الطبيعة .