بعد العمود derivatization مبدأ : تحويل " من الصعب الكشف عن الأحماض الأمينية " إلى " من السهل الكشف عن المشتقات "

الأحماض الأمينية ( باستثناء تريبتوفان ) تفتقر إلى امتصاص الأشعة فوق البنفسجية قوية أو مضان الانبعاثات . حساسية الكشف المباشر منخفضة جدا ( لا يمكن تلبية متطلبات ميكروغرام / لتر تتبع التحليل ) . المنطق الأساسي بعد العمود derivatization هو أن الأحماض الأمينية التي تم فصلها عن طريق التبادل الأيوني العمود الكروماتوجرافى ( عادة فصل طريقة تحليل الأحماض الأمينية ) تتفاعل مع بعض " derivatization كاشف " بعد تدفق العمود على شكل مشتقات مستقرة مع مضان قوية ( أو امتصاص الأشعة فوق البنفسجية قوية ) ، مما يخلق الظروف لمزيد من الكشف عن حساسية عالية .

1 - العمليات الأساسية : الفصل → الاختلاط → رد فعل → الكشف

بعد العمود derivatization النظام يتكون من derivatization كاشف خزان ، خلاط ، رد فعل لفائف ، جهاز التحكم في درجة الحرارة .

فصل الأحماض الأمينية : أنواع كثيرة من الأحماض الأمينية في العينة يتم فصلها عن طريق التبادل الأيوني العمود ( على سبيل المثال ، حمض السلفونيك راتنج تبادل الأيونات الموجبة ) .

كاشف خلط : فصل الأحماض الأمينية تدفق ( مرحلة الجوالة + الأحماض الأمينية ) و derivatized كاشف تدفق ( على سبيل المثال ، indanetrione ، phthalaldehyde OPA ، 9-fluoromethyl chloroformate fmoc ) تماما مختلطة من خلال " تي خلاط " ؛

درجة حرارة ثابتة : رد فعل السائل مختلطة يدخل " التحكم في درجة الحرارة رد فعل لفائف " ( عادة 30-130 درجة مئوية ، اعتمادا على الكاشف ) ، في درجة حرارة معينة تنتج رد فعل الاشتقاق ، الفلورية المشتقة .

في الكشف عن رد الفعل : المشتقات تصب مباشرة في مضان للكشف عن إشارة التقاط .

مبدأ الكشف عن مضان : التقاط إشارة مضان من المشتقات ، وتحقيق التحليل الكمي

الكشف عن مضان على أساس " الذرات " الظاهرة : عندما تشع مضان المشتقة من ضوء الطول الموجي محددة ( ضوء الإثارة ) ، امتصاص الطاقة من الإلكترونات في جزيء ينتقل إلى مستوى عال ، ثم يتم الإفراج عن جزء من الطاقة من خلال nonradiative الانتقال ، ثم تنتقل مرة أخرى إلى أرض الدولة و تنبعث منها ضوء الطول الموجي محددة ( مضان ) . مضان كاشف يحول كثافة مضان في إشارة كهربائية من خلال " الإثارة ضوء الترشيح ، مضان جمع إشارة تحويل " ، وأخيرا يدرك التحليل الكمي من الأحماض الأمينية .

1 - الهيكل الأساسي وتدفق العمل للكشف عن مضان

كاشف مضان يتكون أساسا من مصدر الضوء ، الإثارة مستوحد اللون ، عينة الخلية ، انبعاث مستوحد اللون ، مضخم ضوئي ( PMT ) إشارة المعالج .

الإثارة : توليد الضوء مركب الضوء المنبعث من مصدر الضوء ( عادة زينون مصباح ، والتي يمكن أن توفر 200-800nm الطيف المستمر ) يتم تصفيتها من قبل " الإثارة مستوحد اللون " ( تتألف من صريف و شق ) فقط مع الحفاظ على ضوء أحادي اللون المتطابقة مع " الإثارة الطول الموجي " مشتق ( على سبيل المثال ، OPA مشتق مقابل 340nm الإثارة الخفيفة ) ؛

مضان الإثارة والانبعاثات : ضوء الإثارة يمر من خلال خلية العينة ( التي تتدفق من خلال حل مشتق بعد العمود ) ، جزيء مشتق يمتص الطاقة ثم تنبعث مضان ( مضان اتجاه عمودي على ضوء الإثارة ، وتجنب التدخل من الإثارة الخفيفة ) ؛

مضان الترشيح وجمع : انبعاث مضان هو تصفية من قبل " انبعاث ضوء أحادي اللون " ( إزالة ضوء شارد و لا يمتص ضوء الإثارة ) ، فقط الحفاظ على ضوء أحادي اللون المتطابقة مع " انبعاث الطول الموجي " مشتق ( على سبيل المثال ، مقابل 450nm انبعاث ضوء أوبا المشتقة ) ؛

تحويل الإشارات والكمية : بعد تصفية مضان هو " مضخم أنبوب ( PMT ) " ، PMT تحويل إشارة ضعيفة في نسبة إشارة كهربائية ( الحالية أو الجهد ) ، ثم من خلال معالج الاشارات الرقمية إلى تضخيم التحويل ، توليد " كثافة مضان - الاحتفاظ الوقت " لون الرسم البياني .

الأساس الكمي : وفقا ل " لامبرت بيل القانون مضان تمديد شكل " - في تركيز معين ، كثافة مضان من مشتقات حمض أميني في نسبة مباشرة إلى التركيز ، من خلال مقارنة " كثافة مضان من مشتقات الأحماض الأمينية القياسية ( منحنى قياسي ) " مع " كثافة مضان من عينة من المشتقات " ، يمكننا حساب تركيز الأحماض الأمينية في العينة .

2 - المزايا الأساسية في الكشف عن مضان : حساسية عالية وخصوصية عالية

بالمقارنة مع امتصاص الأشعة فوق البنفسجية للكشف عن مضان الكشف في تحليل الأحماض الأمينية لديها مزايا لا يمكن الاستغناء عنه ، وهذا هو السبب الرئيسي في ما بعد العمود derivatization غالبا ما تستخدم بالاقتران مع الكشف عن مضان :

حساسية عالية : الحد من الكشف عن مضان ( اللد ) يمكن أن تصل إلى nmol / لتر أو حتى pmol / لتر ( 1-3 أوامر أقل من الأشعة فوق البنفسجية ) ، ويمكن الكشف عن كميات ضئيلة من الأحماض الأمينية في عينات بيولوجية ( مثل الدم والبول ) ، مثل زيادة كمية صغيرة من الأحماض الأمينية الناجمة عن الأيض غير طبيعية ؛

خصوصية عالية : فقط يمكن الكشف عن " المشتقات التي يمكن أن تنتج مضان " ، في حين أن المرحلة المحمول والشوائب ( إذا لم تتفاعل مع الكواشف المشتقة ) تقريبا أي إشارة مضان ، والتي يمكن أن تمنع بشكل فعال في ذروة التدخل ( على سبيل المثال ، تحليل الأحماض الأمينية بعد التحلل من البروتين في الغذاء ، لا تحتاج إلى تعقيد المعالجة لإزالة النجاسة ) ؛

مجموعة خطية واسعة : في نطاق تركيز 10 - 10 ، كثافة مضان جيدة العلاقة الخطية مع تركيز الأحماض الأمينية ، ومناسبة لتحديد محتوى مختلف من العينات ( من مايكرو إلى ثابت ) .

منطق التآزر بعد العمود derivatization مضان الكشف .

مزيج مثالي من اثنين من الأحماض الأمينية حل الكشف عن " فصل - الكشف عن " نقطة الألم ، وتشكيل حلقة مغلقة :

بعد الانفصال ، derivatization لتجنب التدخل : بعد العمود derivatization تتم بعد فصل الأحماض الأمينية العمود الكروماتوجرافى ، derivatization كاشف لا تتفاعل مع الشوائب ( مثل البروتينات والأملاح ) في العينة ( الشوائب التي تم فصلها عن العمود الكروماتوجرافى أو لا تحتوي على الأحماض الأمينية ) ، وتجنب " derivatization الشوائب تؤثر على الانفصال " ( قبل العمود derivatization قد تتداخل مع قمم بسبب عملية الاستخراج من المنتجات المشتقة والشوائب ) ؛

بعد derivatization مضان ، حساسية هو تحسين : من خلال derivatization " غير مضان الأحماض الأمينية " يمكن تحويلها إلى " مشتقات الفلورسنت قوية " ، بحيث يمكن الكشف عن مضان التقاط إشارة ضعيفة ، وتلبية متطلبات تتبع التحليل ( مثل التشخيص السريري من الأحماض الأمينية الأيض الطيف الكشف الدقيق ) ؛

كثافة مضان يتناسب طرديا مع تركيز مشتق ( أي تركيز الأحماض الأمينية الأصلي ) و محتوى الأحماض الأمينية يمكن أن تحدد بدقة مع منحنى القياسية ، والنتيجة هي التكرار جيدة ( RSD عادة أقل من 2 في المائة ) .