وعلى الرغم من نجاح استراتيجية الفرز السابقة التي استخدمها المؤلفون لتحديد الطفرات الجينية البشرية البديلة في جينات الخميرة ، فإن هذه الاستراتيجية معقدة ولا تحدد سوى اثنين من القامع ( كاشرو وآخرون ، 2015 ) . هذه التكنولوجيا تحتاج إلى عزل مستعمرة يدويا ، ثمرباعيةوعلاوة على ذلك ، مئات من مستعمرات الخميرة تحتاج إلى فحص يدويا لتحديد مثبطات . ولذلك ، فإن عملية جديدة تم تطويرها من أجل الفرز الآلي عالية الإنتاجية القامع البلازميدات ( الشكل 1 ) .

ونحن نركز بشكل خاص على فحص القامع الطفرات في noncomplementary بيتا 2 ج ( hspsmb7 ) البروتين ، وهو نوع من التعبير التأسيسي proteasome فرعية . هذا الأسلوب يمكن أن يحقق على نطاق واسع و دقة الفحص في تقصير كبير في الوقت . وأجريت التجربة في شكل 96 لوحة المسام ، من خلال تجميع مجموعة وراثية )SGAأو ملم اختيار طريقة فصل فرداني محددة المسوخ ، وبالتالي لا تحتاج إلى فصل الرباعيات ( بان وآخرون ، 2004 ؛ Kuzmin et al . , 2016 ) . باستخدام 5-foa البلازميد تعتمد على الاختيار ، وقد ثبت أن التكامل هو ذات الصلة إلى تحور الجينات البشرية على أساس ura3 البلازميد . باستخدام هذه الاستراتيجية ، ونحن الحصول على العديد من الطفرات في hspsmb7 المثبطة البديلة بنجاح . في هذه الورقة ، والكتاب دائما استخدام مصطلحات مثل " وظيفة استبدال " ، " استبدال " أو " القدرة على استبدال " للإشارة إلى قدرة الجينات البشرية أو المتغيرات لتعويض وظيفة الخميرة مثلي الجينات . عملية الترشيح وضعت على أساس اعتبارات متعددة . النوع البري من البشر psmb7 ( β 2C ) لا يمكن أن تحل محل الجينات المتماثلة من الخميرة β 2 scpup1 ، كما يتضح من الظواهر القاتلة التي لوحظت في القضاء الانتقائي على جينات الخميرة ( الشكل 1 باء ، الملحق رقم 1 باء ) ( كاهيرو وآخرون ، 2015 ) . وعلى النقيض من ذلك ، إذا كانت الجينات البشرية ( أو المتغيرات ) بنجاح محل وظيفة الجينات المضيفة ، سلالة سوف تكون قادرة على النمو ، وبالتالي بمثابة اختبار بسيط مؤشر على وظيفة بديلة . hspsmb7 متحولة الجينات مكتبة تم إنشاؤها في الخميرة مع ura3 المسمى ناقلات التعبير باستخدام استراتيجية الاسترداد مع ارتفاع معدل الخطأ .

من أجل تحديد ما إذا كان أي من psmb7 أليل يمكن أن يعوض عن الوفاة الناجمة عن حذف الجينات من الخميرة مثلي ، والكتاب تحويل مكتبة الجينات الطافرة في الخميرة مضاعفا hetko pup1 pup1 Δ : : kanmx سلالة ( بان وآخرون ، 2004 ) . وقد تم توسيع نطاق التحول إلى الآلاف من مستعمرات الخميرة المعزولة من بعضها البعض ، كل منها يحمل مختلف psmb7 تحور الجين البلازميد ( الشكل 1 باء ) . الآلاف من المستعمرات تم اختيارهم تلقائيا من قبل qpix 460 و تلقيح في 96 المسام على شكل ما قبل sporogenized غنا متوسطة .جي 418pup1 Δ مع kanmx العلامة تم فرزهم من خلال اختيار الأسلوب . بعد تشكيل بوغ ، البقاء على قيد الحياة pup1 Δ : : kanmx فرداني بوغ الخميرة ( في وجود g418 ) مع مختلف حقوق psmb7 الأليلات يمكن اختيارها في ملم متوسطة ( بدون ليو ، الأرجنتين ، أورا ، يمكن ) . كمجموعة تحكم الداخلية بوغ تشكيل الكفاءة ، ونحن أيضا اختبار نمو نوع البرية pup1 فرداني بوغ في ملم متوسطة ( باستثناء g418 ) ( الشكل 1 ج ، أعلى لوحة ) . وأظهرت النتائج أن 19 المستعمرات التي نمت على ملم + g418 متوسطة ( ممثل الصورة في الشكل 1 د ) قد تحمل psmb7 البديل . هذه فرداني تثبيط المسوخ ثم اختبار لتحديد ما إذا كان أو لم يكن تثبيط يعزى إلى تحمل الإنسان متحولة الجينات في البلازميد . بلازميد الاعتماد على خلايا الخميرة تم اختباره على أساس عدم نمو 5-foa الذي يمنع ura3 الجينات . سبعة من أصل 19 تثبيط المسوخ لا يمكن البقاء على قيد الحياة في 5-foa متوسطة ، مما يشير إلى أن المتغيرات الجينية البشرية في هذه السلالات ضرورية من أجل البقاء على قيد الحياة ( الشكل 1 ) .

ومن الناحية المثالية ، أنسنة الخميرة وظيفية توصيف الجينات البشرية سوف تستخدم نوع البرية الأليلات البشرية في الخميرة . ومع ذلك ، فإن البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق فحص القامع و ج محطة الذيل تبادل تشير إلى أن الإنسان β 2C يحتاج طفرة للتفاعل مع الخميرة المجاورة مفارز ، ولا سيما SC β 3 ، بشكل صحيح تجميعها في الخميرة CP . ولذلك ، فإن استراتيجية استعادة هذه حقوق محددة مفارز التفاعل قد تجعل من نوع البرية hspsmb7 متكاملة في الخميرة proteasome . . . . . . . لاختبار هذا الافتراض ، والكتاب يسأل ما إذا كان نوع البرية بيتا 2 ج يمكن أن تحل محل الخميرة نظير وظيفيا في سلالة . طريقة جديدة تقوم على crispr-cas9 وضعت لاستهداف scpup1 ( β 2 ) و scpup3 ( β 3 ) الجينات من الخميرة . تحويل البلازميد الخميرة عن cas9-sgrnascpup1 أو cas9-sgrnascpup3 يؤدي إلى الوفاة . إذا كانت الجينات البشرية يمكن أن تحل محل الخميرةمثلي جينوهكذا ، فإن إصلاح الجينات البشرية قالب يحتوي على 5 ' و 3 ' محطة تماثل تسلسل المقابلة موقع الخميرة هو شارك في تحويلها إلى الخلايا التي من المتوقع أن البقاء على قيد الحياة .

الكتاب الأول اختبار ما إذا كان نوع البرية hspsmb7 يمكن أن تحل محل scpup1 في الموقع ، ولكن لا يمكن الحصول على أي بقاء المستعمرات ، كما هو متوقع ( الشكل 2 ) . ومع ذلك ، باستخدام hspsmb7 البديل مع t44a أو s214g الطفرات ، إصلاح القالب يسمح وظيفية استبدال الجينات pup1 الخميرة ( الشكل 2 باء ) . في وقت سابق ، والكتاب قد أظهرت أنه عندما يتم التعبير عن الجينات بيتا 3 ( pup3 ) في البلازميد ، يمكن استبدالها وظيفيا من قبل الإنسان مثلي الجينات ( hspsmb3 ) ( كاشرو وآخرون ، 2015 ) . باستخدام استراتيجية تستند إلى تقرير التنمية البشرية crispr-cas9 ( ahmetov et al . , 2018 ) ، نجح المؤلفون في استبدال بيتا 3 ( hspsmb3 ) الجينات في الخميرة التحليلية ( الشكل 2 ج ) . ولذلك ، β 2 مفارز من الخميرة يمكن تجنيد حقوق β 3 مفارز في الجزء الأساسي من proteasome الخميرة ، ولكن حقوق β 2 ج مفارز لا يمكن أن تلعب هذا الدور مع الخميرة β 3 مفارز . باستخدام أنسنة سلالة الخميرة بيتا 3 ، تحرير الجينات على أساس crispr-cas9 التكنولوجيا يمكن الآن استبدال بيتا 2 في الخميرة مع نوع البرية البشرية بيتا 2 ج ( hspsmb7 ) الجينات . اثنين من سلالات الخميرة من ح β 2c-hs β 3 يمكن البقاء على قيد الحياة ، والتي تم تحديدها من قبلسانجر التسلسلوقد تم التحقق منها ( الشكل 2 دال ) .

وبناء على ذلك ، من خلال توفير حقوق المجاورة مفارز بيتا 3 ، التي عادة ما تكون غير مكملة حقوق بيتا 2C ، يمكن أن تلعب الآن دورا في الخميرة proteasome . . . . . . . ومع ذلك ، فإن توفير حقوق بيتا 3 في الخميرة لا يمكن أن تكمل الخميرة بيتا 2 من خلال ح β 2 . قياس النمو الكمي أظهرت أن الهندسة سلالات مناسبة للتكيف مع العيوب . أنسنة ح β 2c-s214g سلالة أظهرت انخفاض درجة الحرارة الحساسة عيب في 23 درجة مئوية ، في حين أن أنسنة ح β 2c-t44a سلالة أبطأ من نوع البرية في 23 درجة مئوية و 37 درجة مئوية . وعلاوة على ذلك ، على الرغم من أن أنسنة ح β 3 سلالة مماثلة لتلك التي من النوع البري الخميرة ، أنسنة ح β 2 c-hs β 3 سلالة أظهرت انخفاض درجة الحرارة حساسة النمط الظاهري في 23 درجة مئوية ، وبطء النمو في السائل الثقافة في 30 درجة مئوية .