مقدمة
خلية واحدة تسلسل الحمض النووي الريبي ( scrna-seq ) هو أسلوب غير متحيز لوصف التعبير الجيني في الخلايا والأنسجة المعقدة عينات . على الرغم من أن scrna-seq chedi غيرت علم الأحياء الحديث ، فإنه لا يزال تحديا تقنيا ، وعادة ما تكون مكلفة . الحلول المتاحة حاليا في السوق يمكن أن تكون فعالة في تحليل مجموعة صغيرة من الخلايا عندما يكون هناك عشرات الآلاف من الخلايا في البداية . ومع ذلك ، لا يزال هناك نقص في نظام مبسط لإعداد scrna-seq مكتبة للتعامل مع السكان من الخلايا النادرة . في هذه الورقة ، فإننا تطوير طريقة جديدة للكشف عن scrna-seq مع ارتفاع نسبة التكافؤ الجنسي . . . سير العمل هذا يدعم إعداد عينة نادرة من المكتبات النادرة من السكان . في هذه العملية الجديدة ( الشكل 1 ) ، ونحن نستخدم Dispencell ومخصصة للكشف عن شفط ( البذور biosciences ، سويسرا ) ، مع نظام إعداد مكتبة مخصصة والأمثل خلية واحدة ( ميركوريوس حساسية عالية BRB seq كيت ، Alithea Genomics， سويسرا
تخصيص خلية واحدة
أولا ، نحن اختبار قدرة dispencell لتوزيع الخلايا في حل العازلة الخاصة قبل تسلسل إعداد المكتبة . الخلايا الليمفاوية الذائبة من قارورة مجمدة ، مرت مرتين ، ثم تحصد في خلية واحدة تعليق . 10 ميكرون خلية فلتر ( miltenyi biotec ، ألمانيا ) كان يعمل على تصفية الخلايا ، ثم عد و المخفف إلى 2 × 104 خلايا / مل في rnase مجانا حل ( dispenme البذور biosciences ) . ثم ، يتم تحميل 200 خلية من تعليق خلية باستخدام dispencell الاستشعار شفط . إن dispencell كانت تستخدم لتوزيع الخلايا على 384 لوحة مثقبة مع 4-2 μ ل تقسيم العازلة ( HS BRB seq كيت ، أليثيا جينيكس ) . أول 96 الثقوب المخصصة حوالي 7 دقائق . ثم وقف التوزيع لأن لدينا ما يكفي من العينات لإجراء تحليل المصب .
خلية واحدة لمراقبة الجودة
بعد التوزيع ، ونحن على الفور استخدام البرمجيات dispensoft البذور biosciences لتطوير خلية واحدة لمراقبة الجودة بعد المعالجة . كل ثقب في لوحة تمثل لون ترميز مصفوفة ( الشكل 2 - أ ) . عندما تحتوي على خلية واحدة في حفرة ، البرنامج المسمى الأخضر ، في حين أن الأحمر يحتوي على صفر أو أكثر من الخلايا ، وينبغي التخلص منها . التمييز بين الشظايا والخلايا ، عتبة مجموعة من حجم الرسم البياني القائم على بوابات ( الشكل 2 - ب ) . فقط القمم فوق العتبة تعتبر الخلايا .
هنا ، ونحن الحصول على 77 خلية واحدة المسام ( 80 ٪ معدل عزل خلية واحدة ) . باستخدام dispensoft ، مقاومة البيانات الخام يمكن أن تستخدم أيضا في عملية التسجيل . كل منحنى مقاومة يمكن فحصها يدويا . ذروة واحدة هي سمة من سمات خلية واحدة ( الشكل 2 - ج ) في حين أن العديد من الخلايا تنتج العديد من القمم . هذا يدل على أن dispencell يمكن تخصيص خلية واحدة في حل العازلة مع بسيطة وسريعة wanquan التتبع .