الحمض النووي والبروتين هو أداة رئيسية في مختبر البيولوجيا الجزيئية بسرعة تحديد الحمض النووي والبروتين التركيز . العملية الصحيحة لا يمكن ضمان دقة البيانات ، ولكن أيضا إطالة أمد الحياة من الصك . في هذه الورقة ، فإننا سوف أعرض العملية الأساسية القياسية ، المشاكل المشتركة و المهارات العملية من البروتين والحمض النووي محلل مختبر المبتدئين .
أولاً - الأعمال التحضيرية قبل العملية
1 . أداة معايرة
- معايرة فارغة : قبل كل استخدام ، تحتاج إلى معايرة فارغة مع المياه النقية جدا أو العازلة ( مثل تي عازلة ) للقضاء على خلفية التدخل .
- الصيانة الدورية : إذا كان الصك لم تستخدم لفترة طويلة ، تحتاج إلى إعادة معايرة ، والتحقق من مصدر الضوء ، للكشف عن ما إذا كانت طبيعية .
2 - إعداد العينات
- عينات الحمض النووي : ضمان عدم وجود جسيمات أو شوائب ، الطرد المركزي إذا لزم الأمر ( 12 ، 000 دورة في الدقيقة ، 1-2 دقيقة ) لإزالة الشوائب .
- عينة من البروتين : تجنب تركيزات عالية من المنظفات ( مثل الحزب الديمقراطي الصربي ) ، وذلك لمنع تأثير الامتصاصية الكشف .
3 . اختيار طريقة الاختبار المناسب
- طريقة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية ( على سبيل المثال ، nanodrop ) : هو مناسبة لأنّ التحديد السريع للحمض النووي / الحمض النووي الريبي ( 260nm ) والبروتين ( 280nm ) .
- fluorimetric طريقة ( مثل quabit ) : مناسبة للكشف عن تركيز منخفض من الحمض النووي ، وحساسية أعلى .
إجراءات التشغيل الموحدة ، سوب
1 . بدء التشغيل و التهيئة
- تشغيل الجهاز ، سخني لمدة 5-10 دقائق ( بعض المعدات تحتاج إلى سخن لفترة أطول ) .
- اختيار طريقة الكشف المقابلة ( الحمض النووي / البروتين ) .
2 . إضافة عينة واختبار
1 . تنظيف منصة الاختبار : تراجع كمية صغيرة من المياه النقية جدا أو الكحول مع ورقة نظيفة لمسح سطح الاختبار ، وتجنب التلوث المتبقية .
2 . إضافة عينة :
- Nanodrop نوع الصك : إضافة 1-2 ميكروغرام من العينة إلى منصة الاختبار ، وانخفاض الكشف عن الذراع .
- أجهزة قياس الألوان : تأكد من تنظيف أطباق قياس الألوان وإضافة كمية مناسبة من العينات ( عادة 50-200 ميكروغرام / لتر ) .
القراءة : انقر على " قياس " لتسجيل البيانات .
4 . تنظيف : بعد الانتهاء من الاختبار ، على الفور استخدام المياه النقية جدا أو الإيثانول لتنظيف اختبار مقاعد البدلاء ، لمنع تأثير عينة من التبلور بعد الاختبار .
3 - تسجيل البيانات وتحليلها
- تحديد نقاء الحمض النووي :
الحمض النووي : a260 / a280 ∶ 1.8 ( الحمض النووي النقي ) ، a260 / a230 > 2 ( لا تلوث ) .
الجيش الملكي النيبالي : a260 / a280 ∶ 2.0 ( الجيش الملكي النيبالي ) .
- إذا كانت نسبة غير طبيعية ( على سبيل المثال ، a260 / a280 < 1.6 ) ، قد تشير إلى تلوث البروتين أو الفينول .
- تحديد البروتين : عند استخدام برادفورد أو اتفاق التعاون الأساسي ، منحنى القياسية المطلوبة .
المشاكل المشتركة والحلول
1 - الكشف عن نتائج غير طبيعية ( مثل نسبة A260 / A280 منخفضة )
- الأسباب المحتملة : تلوث البروتينات أو المذيبات العضوية .
- الحل : إعادة تنقية العينة ، أو التحول إلى الأسلوب الكمي الفلورسنت ( مثل Qubit ) .
2 - خطأ في الصك ( مثل " العينة المركزية " )
- الأسباب المحتملة : تركيز العينة خارج نطاق الاختبار .
- الحل : تمييع العينة بعد إعادة الاختبار .
3 - الانجراف أو عدم الاستقرار في خط الأساس
- الأسباب المحتملة : مكتب اختبار التلوث أو الشيخوخة مصدر الضوء .
- الحل : تنظيف طاولة الاختبار ، أو الاتصال بمهندس لمعايرة مصدر الضوء .
رابعاً - المهارات العملية
1 . تجنب تدخل فقاعة : عند إضافة عينة ، تأكد من قطرات كاملة ، لا فقاعات ، وإلا فإنه سوف يؤدي إلى امتصاص التقلبات .
2 . انخفاض تركيز عينة اختبار :
- الكمية باستخدام طريقة fluorimetric ( مثل Qubit ) أكثر حساسية من الأشعة فوق البنفسجية .
- إذا كان يجب استخدام طريقة الأشعة فوق البنفسجية ، يمكن زيادة حجم العينة بشكل مناسب ( على سبيل المثال 2 ميكرولتر → 3 ميكرولتر ) .
3 . التخزين على المدى الطويل التوصيات :
- تشغيل على الأقل مرة واحدة في الأسبوع لمنع العناصر البصرية من الحصول على الرطب .
- تخزينها في بيئة جافة وخالية من الغبار .