[طرق علاج heterobanding الاسترداد] .

. . . أنا

تفاعل البلمرة المتسلسل ( PCR ) و الاستشراب هلام تستخدم عادة في علم الأحياء الجزيئي ، وعادة ما تستخدم في تركيبة مع تحديد وتحليل المنتجات PCR التضخيم . ومع ذلك ، غالبا ما يتم العثور على heterobands في الاستشراب هلام بوليميريز سلسلة من ردود الفعل ، والتي قد تتداخل مع النتائج التجريبية أو حتى يؤدي إلى فشل التجارب .

في هذه الورقة ، ونحن التحقيق في أسباب heterobanding خلال الاسترداد الاستشراب هلام ، وتقديم بعض الحلول الممكنة .

( أ ) وظيفة جديدة .

تحسين ظروف الاسترداد :تعديل شروط الاسترداد ، وانخفاض درجة حرارة التلدين يمكن أن يؤدي إلى عدم التحديد ملزمة التمهيدي مع القالب ، مما يؤدي إلى عدم التحديد التضخيم . إذا كانت درجة حرارة التخمير عالية جدا ، فمن الممكن أن تمنع من الجمع بين الاشعال مع القالب ، مما يؤثر على كفاءة التضخيم . عموما ، درجة حرارة التخمير خطوة تفاعل البلمرة المتسلسل هو عادة ما بين 50 درجة مئوية و 68 درجة مئوية ، اعتمادا على تسلسل قاعدة التمهيدي و خصائص الحمض النووي المستهدف . بعض الاشعال تتطلب أعلى درجة حرارة التلدين للتأكد من أن منطقة معينة محددة ملزمة ، ولكن عموما ، أعلى درجة حرارة التلدين لا تتجاوز 68 درجة مئوية .

( أ ) وظيفة جديدة .

تصميم الاشعال غير معقول :إذا كان طول التمهيدي قصيرة جدا ، أو تكرار تسلسل عالية ع المنطقة ، قد يؤدي إلى غير محددة ملزمة التمهيدي إلى قالب ، مما أدى إلى heterobanding . . . . . . . الاشعال تحتاج إلى إعادة تصميم للتأكد من أن الاشعال هي مناسبة في الطول ، لا تكرار تسلسل ع المحتوى المعتدل ، وتجنب ارتفاع ع المناطق داخل الاشعال أو في منطقة ملزمة بين الاشعال و القالب .

( أ ) وظيفة جديدة .

سوء استخدام التمهيدي :الإفراط في استخدام التمهيدي أو عدم التحديد قد يؤدي إلى تضخيم غير محددة ، مما أدى إلى heterobands . . . . . . . فمن المستحسن أن مبادلة أو تقليل استخدام التمهيدي التمهيدي .

( أ ) وظيفة جديدة .

قالب : نجسقالب الحمض النووي يحتوي على شوائب مثل البروتين ، والجيش الملكي النيبالي ، أو غيرها من الحمض النووي غير المستهدفة شظايا ، والتي قد تكون بمثابة قالب PCR التضخيم ، مما يؤدي إلى ظهور المزيد من العصابات .

( أ ) وظيفة جديدة .

قالب : تدهورقالب الحمض النووي هو المتدهورة في عملية الاستخراج أو التخزين ، مما أدى إلى شظايا صغيرة من الحمض النووي قد تصبح غير محددة التضخيم القالب .

( أ ) وظيفة جديدة .

تنقية الحمض النووي قالب :قالب الحمض النووي في تفاعل البلمرة المتسلسل ( PCR ) يمكن أن تأتي من مجموعة متنوعة من المصادر ، بما في ذلك الحمض النووي الجينوم ( GDNA ) ، مكملة الحمض النووي ( كدنا ) بلازميد الحمض النووي . ومع ذلك ، فإن تكوين وتعقيد الحمض النووي من مصادر مختلفة قد تختلف ، والتي قد تؤثر على كمية الأمثل بكر التضخيم . على سبيل المثال ، في 50 ميكرولتر من تفاعل البلمرة المتسلسل ، بلازميد الحمض النووي يتطلب فقط 0.1-1 نانوغرام ، في حين أن الحمض النووي يتطلب 5-50 نانوغرام . وبالإضافة إلى ذلك ، فإن نوع بوليميريز الحمض النووي المستخدمة يمكن أن تؤثر أيضا على أفضل قالب بدء المبلغ . تعديل بوليميريز الحمض النووي لديها أعلى تقارب وحساسية القالب ، وبالتالي فإن كمية الحمض النووي الأولي المطلوب هو أقل نسبيا . الاستفادة المثلى من الحمض النووي بدء أمر بالغ الأهمية ، لأن الإفراط في بدء قد يؤدي إلى زيادة خطر التضخيم غير محددة ، في حين أن انخفاض بدء قد يقلل من الاسترداد الغلة . في بعض الأحيان ، بكر مخططات استخدام عدد النسخ التي تمثل بداية الحمض النووي ، ولا سيما GDNA . . . . . . . حساب عدد النسخ ينطوي على avogadro ثابت و الكتلة المولية ، صيغة محددة هي : عدد النسخ = ل × عدد المولي = ل * ( مجموع الكتلة / الكتلة المولية ) .

( أ ) وظيفة جديدة .

تركيز مغ ۸ مرتفع جداً :مغ ۸ هو عنصر هام في تفاعل البلمرة المتسلسل ( PCR ) . ومع ذلك ، فإن تركيزات عالية من مغ ۸ يمكن أن تقلل من خصوصية PCR التضخيم وزيادة خطر غير محددة التضخيم . أفضل تركيز ملغ ۸ ينبغي تحديدها من خلال التجربة .

( أ ) وظيفة جديدة .

كمية الانزيم أو نوعية رديئة :كمية عالية من الانزيمات أو نوعية رديئة من الإنزيمات يمكن أن تؤثر على تفاعل البلمرة المتسلسل ( PCR ) . فمن المستحسن للحد من كمية الانزيم أو استبدال الإنزيم من مصدر آخر .

( أ ) وظيفة جديدة .

استخدام الحرارة بدء الاسترداد :بكر يمكن أن تقلل من التضخيم غير محددة بسبب رد الفعل في درجة حرارة منخفضة .

بدء التشغيل الحراري PCR هو تقنية تستخدم للحد من التضخيم غير محددة . في التقليدية PCR ، التمهيدي قد تكون ملزمة قالب الحمض النووي قبل رد فعل درجة الحرارة تصل إلى درجة حرارة التضخيم . هذا قد يؤدي إلى تضخيم غير محددة في بداية الاسترداد ، مما أدى إلى heterobanding أو نتائج إيجابية كاذبة . الحرارة بدأت بكر يحل هذه المشكلة عن طريق إضافة الحرارة مستقرة بوليميريز الحمض النووي في تفاعل البلمرة المتسلسل ( PCR ) .

مفتاح الساخنة بدء الاسترداد هو استخدام بوليميريز التي تتطلب درجة حرارة عالية التنشيط . هذه الإنزيمات تصبح نشطة في درجات حرارة أعلى ، وبالتالي تبدأ في تضخيم تسلسل الحمض النووي المستهدف في بداية رد الفعل دون التسبب في رد فعل غير محدد في درجات حرارة منخفضة .

بعض من الأكثر استخداما على نطاق واسع الساخنة بدء بوليميريز تشمل تحسين إصدارات مستقرة حراريا طق بوليميريز الحمض النووي ، مثل طق بوليميريز الحمض النووي مع حراريا تنشيط المجال ، عالية الدقة بوليميريز مثل pfu أو فيوجن .

حتى الآن الإنزيمات أساسا تلبية الشروط .

( أ ) وظيفة جديدة .

فحص بيئة المختبر :تجنب الحمض النووي من التلوث وتلوث المعدات التجريبية ، واستخدام التكنولوجيا العقيمة و الكواشف المعالجة ، والحفاظ على مختبر نظيفة .

( أ ) وظيفة جديدة .

التدرج PCR الأمثل :التدرج في درجة الحرارة المستخدمة في تفاعل البلمرة المتسلسل ( PCR ) للكشف عن درجة حرارة محددة التضخيم .

ذكي ثنائي الأبعاد التدرج بكر الصكوفي الوقت نفسه ، يمكن أن يكون الأمثل لمسخ و التدرج في درجة الحرارة الصلب لمسخ في وقت واحد في نفس رد الفعل ، يمكن تعيين درجة حرارة التخمير 12 صف طوليا و 8 صفوف أفقيا لمسخ التدرجات ، وبالتالي تحسين درجة حرارة التخمير الأمثل ، وبالتالي تحسين خصوصية وكفاءة تفاعل البلمرة المتسلسل ( PCR ) .

هذه التقنية هي مفيدة جدا لتحسين التمهيدي ، قالب بكر الظروف لضمان جودة عالية ومحددة بكر المنتجات التي تم الحصول عليها .

هذه الأساليب يمكن استخدامها منفردة أو مجتمعة للمساعدة في الحد من أو القضاء على بكر heterobanding المشاكل .