مبدأ التقنية وعملية تدفق متعدد القنوات المحلية لطخة ويسترن الصك يعتمد أساسا على كفاءة ودقة الكشف عن البروتين . وجافاسكريبت الغربية ( لطخة غربية ) هو نوع من التكنولوجيا التجريبية المستخدمة في الكشف عن وتحليل بروتين معين التعبير .
وفيما يلي المبادئ التقنية وإجراءات التشغيل من القنوات المحلية لطخة غربية :
مبدأ التقنية
المبدأ الأساسي من لطخة غربية هو أن البروتينات في العينة يمكن فصلها حسب الوزن الجزيئي عن طريق الاستشراب هلام ، ثم البروتينات المعزولة يمكن نقلها إلى الغشاء عن طريق تحويل الغشاء . ثم ، من خلال ربط الأجسام المضادة المحددة على الغشاء ، وجود كمية من البروتين التعبير يتم الكشف عنها .
متعدد القنوات لطخة غربية أداة تستخدم أساسا لتحقيق المعالجة المتوازية من عدة قنوات في عينة واحدة أداة لتحسين الكفاءة التجريبية . . . . . . . وتشمل مبادئها التقنية الأساسية :
عزل البروتين
هلام بولياكريلاميدي الاستشراب ( صفحة الحزب الديمقراطي الصربي ) : البروتينات في العينة التي تم فصلها عن طريق هلام بولياكريلاميدي الاستشراب ( صفحة الحزب الديمقراطي الصربي ) .
نقل البروتين
غشاء : نقل البروتينات المعزولة من هلام ( عادة PVDF غشاء أو غشاء النيتروسليلوز ) عن طريق النقل الكهربائي . البروتينات على الغشاء سوف تكون ثابتة في مواقع محددة .
الكشف عن البروتين
احتضان الأجسام المضادة : عن طريق استخدام الأجسام المضادة المحددة ( عادة الأجسام المضادة ضد البروتين المستهدف ) ، الأجسام المضادة ملزمة البروتين المستهدف على الغشاء .
تشيميلومينيسسينسي أو رد فعل اللونية : انزيم المسمى الأجسام المضادة الثانوية ملزمة البروتين المستهدف ، من خلال رد فعل تشيميلومينيسسينسي أو رد فعل اللونية لإنتاج إشارة ، من خلال نظام التصوير للكشف عن وجود البروتين والتعبير .
تقنية القنوات
على أساس التقليدية قناة واحدة لطخة غربية ، متعدد القنوات لطخة غربية يمكن أن عملية متعددة القنوات في وقت واحد في نفس التجربة . وقد تحقق ذلك من خلال العديد من الثقوب عينة وبالتوازي مع العملية ، مما يحسن من كفاءة التجربة و المقارنة بين البيانات .
عملية تدفق
عملية التشغيل من القنوات المحلية لطخة غربية وعادة ما تشمل الخطوات الرئيسية التالية :
1 - إعداد العينات
جمع عينات من الخلايا أو الأنسجة التي سيتم الكشف عنها .
كسر الخلايا مع تقسيم العازلة لاستخراج البروتين .
البروتين المستخرج هو كميا لضمان المساواة في كمية البروتين المضافة في كل عينة .
صفحة الحزب الديمقراطي الصربي الكهربائي
إعداد هلام بولياكريلاميدي ، وعادة ما تستخدم صفحة الحزب الديمقراطي الصربي هلام ، الحزب الديمقراطي الصربي ( دوديسيل كبريتات الصوديوم ) المستخدمة في تدمير بنية البروتين ، بحيث تحمل شحنة سالبة و الوزن الجزيئي حجم الفصل .
عينات تم تحميلها في هلام ، الكهربي أجريت في المجال الكهربائي لفصل البروتينات مع مختلف الأوزان الجزيئية .
3 . تحويل الفيلم
البروتينات في هلام يتم نقلها إلى PVDF الأغشية أو الأغشية النيتروسليلوز . . . . . . . عملية التحويل عادة ما يتحقق من خلال نقل الكهرباء .
باستخدام غشاء نقل الصك ( على سبيل المثال ، غشاء نقل وحدة في القنوات لطخة ويسترن الصك ) ، المعلمات مثل التيار الكهربائي ، والجهد ، نقل الوقت ، وما إلى ذلك يتم تعديلها لضمان كفاءة نقل موحدة من البروتين إلى الغشاء .
4 - منع
غشاء تعامل مع إغلاق الحل ( على سبيل المثال ، 5 ٪ مسحوق الحليب الخالي من الدسم أو جيش صرب البوسنة الحل ) لمنع الأجسام المضادة من ربط أجزاء أخرى من الغشاء .
5 - احتضان الأجسام المضادة
مضاد الحضانة : وضع الغشاء في محلول مضاد ، وعادة مع الأجسام المضادة الأولية المحددة ضد البروتين المستهدف . وقت الحضانة يمكن أن تختلف من ساعة إلى ليلة وفقا لخصائص الأجسام المضادة .
مضاد حاضنة : حاضنة مع الأجسام المضادة الثانوية المسمى الانزيمات ( مثل هورس راديش پراكسيداز HRP ) أو غيرها من الجزيئات التي يمكن الكشف عنها من أجل تعزيز الإشارات .
6 . تشيميلومينيسسينسي الكشف
باستخدام تشيميلومينيسسينسي ركائز ، مثل القامة ، HRP انزيم يحفز تألق من ركائز .
نظام التصوير ( مثل نظام التصوير تشيميلومينيسسينسي ) يستخدم لالتقاط إشارة مضيئة لتوليد البروتين الكشف عن الصورة .
متعدد القنوات تصميم متعدد القنوات لطخة غربية يسمح التقاط إشارة من عينات متعددة في وقت واحد ، وبالتالي تحسين الكفاءة .
7 - تحليل البيانات
مستوى البروتين التعبير تم تحليلها على أساس الكشف عن الشريط السطوع والحجم . كثافة الشريط يتناسب مع التعبير عن البروتين المستهدف .
تم استخدام البرمجيات لتحليل كمي الشريط ، مقارنة مع معيار قياس البروتين ، البروتين التعبير النسبي تم حسابها .
ميزة مميزة
متعدد القنوات عملية موازية : يمكن معالجة عينات متعددة في وقت واحد ، وتحسين كفاءة العمل وقابلية البيانات للمقارنة .
درجة عالية من الأتمتة : من خلال جهاز التحكم الآلي غشاء ، جسم الحضانة ، والغسيل وغيرها من الخطوات ، والحد من الأخطاء البشرية .
حساسية عالية ، وارتفاع تدفق : مناسبة للكشف عن انخفاض وفرة البروتين ، ويمكن التعامل مع عدد كبير من العينات .
نطاق التطبيق : يمكن استخدامها في العديد من التجارب ، مثل تحليل البروتين التعبير الأجسام المضادة محددة للتحقق من البروتين البروتين البروتين التفاعل .
الاستنتاج
متعدد القنوات المحلية لطخة ويسترن الصك يحسن إلى حد كبير كفاءة ودقة لطخة ويسترن التجربة من خلال كفاءة التشغيل الآلي . فإنه يوفر تدفق أعلى وأسرع أداة الكشف عن البروتين للباحثين ، وخاصة عندما تحتاج إلى التعامل مع عينات متعددة في وقت واحد ، فإنه يظهر ميزة كبيرة .