في الوقت الحقيقي الاسترداد الفلورسنت ( qpcr ) في الوقت الحقيقي رصد عملية التضخيم الحمض النووي من خلال إشارات الفلورسنت ، تفسير البيانات يجب أن تكون جنبا إلى جنب مع التضخيم منحنى ، CT قيمة ذوبان منحنى تحليل شامل .

النقاط الرئيسية في تفسير البيانات

تحليل منحنى التضخيم

منحنى التضخيم العادي ينبغي أن يكون " S " نوع ، بما في ذلك خط الأساس ، مؤشر المرحلة ، مرحلة . إذا كان منحنى يظهر في وقت مبكر ( غير محددة التضخيم ) أو في وقت متأخر من مرحلة تذبذب منصة ( مضان التبريد ) ، قد تشير إلى تدهور ديمر التمهيدي أو كاشف . على سبيل المثال ، 30 ٪ من العينات التي تم تضخيمها في المختبر بسبب استخدام مسبار عفا عليها الزمن .

CT قيمة الحكم

CT القيم ( عتبة الحلقات ) تعكس كمية من القوالب الأولية ، وضمان أن تكون ضمن مجموعة خطية من منحنى القياسية ( عادة 15-35 الحلقات ) . إذا كان التصوير المقطعي قيمة منخفضة بشكل غير طبيعي ( < 15 ) ، قد يكون هناك تلوث . إذا كان على الجانب عالية ( > 35 ) ، من الضروري التحقيق في تدهور العينة أو كفاءة الاستخراج . الفحص السريري أظهرت أن متوسط قيمة CT تأخر ثلاث دورات بعد 48 ساعة من تخزين عينات الدم .

ذوبان منحنى التحقق

ذروة واحدة ذوبان منحنى ( TM قيمة متسقة ) يدل على التضخيم محددة ، قمم مزدوجة أو متعددة تشير إلى التمهيدي ديمر أو غير المستهدفة المنتج . على سبيل المثال ، إذا كانت درجة حرارة انصهار انحرفت عن المتوقع ( على سبيل المثال ، الهدف المنتج TM = 82 ℃ ، 78 ℃ الذروة الفعلية ) في سيبر الأخضر طريقة الاختبار ، التمهيدي يحتاج إلى إعادة تصميم .

المشاكل المشتركة والحلول

لا التضخيم أو تأخير التضخيم

الأسباب : قالب التدهور ، فشل التمهيدي ، وعدم كفاية نشاط انزيم .

الحل : إعادة استخراج الحمض النووي / الجيش الملكي النيبالي ، وذلك باستخدام الاشعال الطازجة ، والتعبئة والتغليف انزيم كاشف لتجنب تكرار التجميد والذوبان .

التضخيم غير محدد

السبب : سوء تصميم التمهيدي ، وانخفاض درجة حرارة التخمير .

الحل : الأمثل التمهيدي ( GC المحتوى 40-60 ٪ ، طول 18-22bp ) ، وزيادة درجة حرارة التلدين 5 ℃ . . . . . . .

ضعف التكرار

السبب : إضافة عينة خطأ ، أداة التحكم في درجة الحرارة تقلب .

الحل : استخدام بندقية مع عينة ، معايرة المعدات بانتظام ( مثل درجة الحرارة دقة ± 0.2 ℃ ) .

إشارة مضان الشذوذ

السبب : روكس إشارة صبغ مفقود ، فلتر خلع .

الحل : إضافة صبغة روكس ، والتحقق من مسار الضوء نظام الصك .

اقتراح لمراقبة الجودة

في كل تجربة سلبية ( بدون قالب ) و ( مراقبة إيجابية معروفة تركيز القالب ) تم تعيين .

منحنى القياسية ص ≥ 0.99 و التضخيم كفاءة 90-110 ٪ .

تنظيف مسار الضوء بانتظام ، وتجنب الغبار التي تؤثر على الكشف عن مضان .

من خلال منهجية تحليل شكل منحنى التضخيم ، CT قيمة التوزيع و ذوبان منحنى المميزة ، جنبا إلى جنب مع تدابير صارمة لمراقبة الجودة ، والموثوقية والتكرار qpcr البيانات يمكن أن تحسن بشكل ملحوظ .