اختبار المخدرات الكبد والكلى الأجهزة جنبا إلى جنب coculture

اختبار جرعة متكررة متعددة الأدوية باستخدام زراعة مشتركة قائمة على رقاقة الميكروفلويديك من مكافآت الأنابيب القريبة للكبد والكلى البشرية

baisite بكين التكنولوجيا المحدودة

multiorgan ميكروفلويديك سلسلة رقاقة يمكن أن تحاكي المكروية من زراعة الأنسجة والأعضاء ، وتحقيق سلسلة من زراعة الأنسجة والأعضاء والحد من الاختلافات بين الأنواع . الصين الغذاء والدواء معهد البحوث ، معهد تقييم السلامة ( المركز الوطني لتقييم ورصد سلامة الدواء ) ، جامعة العلوم الطبية الأساسية في العاصمة ، بكين معهد مراقبة المخدرات ، معهد برلين للتكنولوجيا ، ألمانيا ، بالاشتراك مع العلماء في ألمانيا tissuse GmbH ، أنشأت ميكروفلويديك المستندة إلى نموذج الجهاز ، يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع الكبد والكلى الأجهزة ، وشارك في الثقافة لمدة 16 يوما . وفي الوقت نفسه ، 14 يوما من تكرار جرعة من السيكلوسبورين أ ( وكالة الفضاء الكندية ) أو الريفامبين تدار بشكل منفصل . مقارنة بين اثنين من جرعات مختلفة من وكالة الفضاء الكندية على مختلف الأجهزة المستهدفة ، مقارنة مع 14 يوما متتالية من وكالة الفضاء الكندية ، جنبا إلى جنب مع ريفامبيسين من اليوم السادس يمكن أن تقلل من تركيز وكالة الفضاء الكندية والحد من سمية . جنبا إلى جنب coculture الكبد والكلى الأجهزة على الجهاز مثل رقاقة يدل على قدرتها على أن تكون أداة فعالة في الكشف عن المخدرات سمية متعددة تكرار الجرعة في مرحلة ما قبل السريرية المخدرات التنمية .

المخدرات التي يسببها الكلوي والكبد ترتبط مع شدة الاعتلال والوفيات . الكلى تلعب دورا رئيسيا في الحفاظ على التوازن المنحل بالكهرباء ، والتعامل مع الترشيح ، إفراز ، وإعادة امتصاص . إزالة المواد الخارجية من خلال النقل النشط ( إعادة امتصاص أو إفراز ) من الكلى القريبة من الأنابيب المنحنية ، التي تستفيد من استقطاب قوي من الخلايا الظهارية أنبوبي القريبة التي تعبر عن نقل وظيفية البروتين . الكبد يتحكم في استقلاب المواد الخارجية ، في حين أن الكلى هي المسؤولة عن إخراجه من الجسم . تركيزات البلازما والتوافر البيولوجي من المواد الخارجية يمكن أن تتغير من خلال الكبد السمية / إزالة السموم ، مما يؤدي إلى تغييرات في الكلى . وهكذا . الكلى و الكبد هي الأهداف الرئيسية من المركبات السامة . في الوقت الحاضر ، قبل السريرية النماذج المستخدمة لإثبات المخدرات الكلوي و الكبد تشمل في المختبر والمجراة في النماذج . ومع ذلك ، نماذج حيوانية لا يمكن محاكاة المكروية في الجسم الحي في ظل ظروف ثابتة بسبب القيود المفروضة على الوقت الطويل زراعة الحيوان الأخلاق .

من أجل دعم toxcast / tox21 المشروع ، المزيد من أساليب التنبؤ عالية الإنتاجية تقييم السمية ينبغي استكشافها . تطوير الأجهزة البشرية رقاقة التكنولوجيا يتغلب على عيوب قبل السريرية الحالية نموذج يدعم مبدأ 3R ( أي استبدال ، والحد من الاستخدام الأمثل للحيوانات ) . في الوقت الحاضر ، الجهاز مثل سلسلة رقاقة متكاملة مع مضخة ميكروفلويديك و الجهاز مثل الثقافة ، مما يجعل نسبة السائل والأنسجة مماثلة لتلك التي في جسم الإنسان . الكبد والكلى جنبا إلى جنب رقاقة يمكن أن تلبي توزيع وتبادل المواد الغذائية والمركبات العضوية مثل الأيضات في النظام .

الشكل 1 - سلسلة رقاقة ميكروفلويديك الكبد والكلى الأجهزة . ( أ ) رسم بياني لتكبير الجهاز ، بما في ذلك رقائق PDMS التي تحتوي على مسارين صغيرين . ( ب ) أحمر غامق السهم يدل على اتجاه تدفق السائل في ميكروتشانيلس و الإعداد التجريبي المشارك ثقافة الكبد والكلى الأجهزة في وزارة التجارة . ( ج ) رسم تخطيطي لما مجموعه 16 يوما من الثقافة ، بما في ذلك 2 أيام من فترة التكيف و 14 يوما من الإدارة المتكررة ، والتبادل اليومي لوسائل الإعلام ، وجمع طاف في 1 و 7 و 14 يوما ، وجمع عينات من الخلايا في 0 و 14 يوما .

التوازن يضمن أنه يمكن ملاحظة مراحل مختلفة من تلف الكبد و / أو الكلى . وبالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تشكل الخلايا أنبوبي كلوي الإنسان حاجز كامل والتعبير عن الإنزيمات الوظيفية و الناقلين التي هي حاسمة في المخدرات التي يسببها تلف الكلى و المخدرات التفاعلات . شارك في زراعة الكبد عن علامات محددة ، والإنزيمات البشرية ، والنقل ، على مستوى مماثل أو أعلى من 2D خلية ثقافة ، واستمر لمدة 28 يوما على الأقل .

السيكلوسبورين ( وكالة الفضاء الكندية ) هو نوع من مناعة الكلى والكبد سمية ، ويستخدم كنموذج المخدرات لتحفيز الكبد والكلى المشارك ثقافة النظام القائم على رقاقة . لمزيد من تقييم استقلاب المخدرات وسمية على ثنائي الجهاز رقاقة ( 2-oc ) ، ونحن استخدام وكالة الفضاء الكندية جنبا إلى جنب مع ريفامبيسين ( طلب تقديم العروض ، الكبد انزيم الناقل محفز ) . الدراسات الدوائية والدوائية سمية وكالة الفضاء الكندية إلى أن هناك اختلافات كبيرة بين الأنواع المختلفة ، ولا سيما في التمثيل الغذائي . وبناء على ذلك ، وفقا للجرعة المستخدمة في التجارب السريرية ، واثنين من جرعات مختلفة من وكالة الفضاء الكندية ( غير سامة / سامة جرعة ) و طلب تقديم العروض جرعة علاجية تطبق على الجهاز الثاني جنبا إلى جنب رقاقة .

بقدر ما نعلم ، هذا هوشوكيوقد أظهرت الدراسات أن الكبد والكلى شارك في الثقافة على أساس نموذج ميكروفلويديك ميكروأري يمكن استخدامها في دراسة السمية المتكررة وحدها أو مجتمعة لمدة 14 يوما . الكبد والكلى ميكروأري الجهاز يمكن أن تحاكي عملية التفاعل المخدرات في جسم الإنسان و تأثيرها على السمية . وأظهرت النتائج أن الكبد والكلى الأجهزة جنبا إلى جنب cocultured ميكروأري يمكن الكشف عن المؤشرات الحيوية في تركيبة مع التشكل ، علم الأنسجة ، علم الأحياء الجزيئي ، استقلاب المخدرات وغير الغازية سمية لتوضيح التفاعلات الدوائية والتمثيل الغذائي والسمية .

النتيجة

نحن تصميم جهاز ثنائي رقاقة التي يمكن أن تستوعب اثنين من نفس microfluidic المسارات ، كل حلقة ربط الحاجز أنبوبي القريبة مع الأجهزة الحشوية في سلسلة . ( الشكل 1 ألف / باء ) .

خصائص وسلامة وظيفة الحاجز الكلوي القريب :rptec / tert1 الخلايا المستزرعة على transwell ، ثم تفرق في طبقة واحدة كاملة ( الشكل 2 ) . immunofluorescence تلطيخ أظهرت أن rptec / tert1 الخلايا الظهارية علامة ck8 / 18 ( الشكل 2 باء ، ج ) . تشكيل أهداب الأولية لوحظ من قبل تلطيخ أستلة أنيبيب ( الشكل 2 ) . الشكل 2 هـ و الشكل 2 تظهر التعريب من جواز سفر يقرأ إلكترونيا - 2 و نا + ك + أتباز ، على التوالي ، والتي هي مؤشرات وظيفية الاستقطاب أحادية rptec . . . . . . . التعبير عن zo-1 ( الشكل 2 ز ) و ( claudin-10 الشكل 2 حاء ) في حدود الخلية إلى أن هناك علاقة وثيقة بين الخلايا المجاورة rptec / tert1 ، مما يدل على استقطاب الخلايا المناسبة وسلامة الحاجز . تلطيخ إيجابية Ki67 ( الشكل 2 ) يظهر انتشار الخلايا .

في الشكل 2 ي ل ، RT-QPCR نتائج وظيفية نقل البروتينات mrp-2 p-gp , و ki67 خلال 16 يوما من الثقافة في 2-ocs تم عرضها .

الشكل 2 - خصائص الحاجز الكلوي القريب . ( أ ) transwell شكلت طبقة واحدة من الخلايا الكلوية القريبة . ( ب ) ck8 / 18 ( الأخضر ) ( ج ) ck8 / 18 ( الأخضر ) ، عبر الباب ( د ) أستلة أنيبيب ( الأخضر ) ( هـ ) جواز سفر يقرأ إلكترونيا - 2 ( الأحمر ) ( و ) الصوديوم والبوتاسيوم أتباز ( الأحمر ) ( ز ) zo-1 ( الأحمر ) ( ح ) claudin-10 ( الأحمر ) ( ط ) ki67 ( الأحمر ) . نوى كانت ملطخة dapi ( الأزرق ) . مقياس : ب ، د ، ه : 100 μ م ؛ ج ، و ، ز ، ح و أنا : 50 μ م . التعبير الجيني ( ي ) mrp-2 ( ك ) p-gp ( ل ) ki67 تم تحليلها من قبل qrt-pcr . . . . . . . البيانات هي متوسط ± الخطأ المعياري .

ميزات ووظائف الكبد :مورفولوجيا وتمايز الخلايا heparg ، تشكيل الكبة ، immunofluorescence تلطيخ ، RT-PCR تحليل الإنزيمات الكبدية و الناقلين . الشكل 1 . أظهرت النتائج أن المجال الكبدي في ميكروفلويديك multiorgan سلسلة رقاقة لديها خصائص الحفاظ على المدى الطويل وتكرار التمايز .

أداء الجهاز الثاني جنبا إلى جنب رقاقة الثقافة لمدة 16 يوما :الكشف عن مستويات LDH في الجهاز الكلوي ( ممثل نظام الإفراز ) و قناة مايكرو المسار ( بدلا من الدورة الدموية ) أظهرت أن مستويات LDH الإنتاج في نظام الإفراز و الدورة الدموية في الجهاز الثاني رقاقة ظلت مستقرة ، مما يشير إلى أن الخلايا في مختلف الدوائر الثقافية البشرية مستقرة الفسيولوجية خلال 16 يوما من coculture . . . . . . .

قياس مستويات الجلوكوز في اثنين من وسائل الإعلام خلال 16 يوما coculture ويرد في الشكل 3 باء . تركيز الجلوكوز في قنوات متناهية وثقافة الدوائر بدقة الحفاظ على ما بين 2.5 ملم و 6 ملم لضمان ما يكفي من الطاقة إلى ثنائي الجهاز رقاقة . مستويات الجلوكوز في الأنابيب القريبة حوالي ثلاث مرات أقل من 17.5 ملم في المتوسط الأولي . تركيز الجلوكوز في الدورة الدموية microchannel استمرت في الانخفاض إلى 50 ٪ من 11.1 مم الأولي ، في نطاق السكر في الدم الطبيعي . هذه النتائج تشير إلى أن الجهاز ثنائي ميكروأري إنشاء توازن الجلوكوز مستقرة جدا خلال 16 يوما من hepatorenal حبلا coculture . . . . . . .

صورة3 ، 16 يوما في الكبد والكلى الجهاز المشارك ثقافة النظام . ( أ ) نشاط الأنسجة في 2-oc النظام عن طريق قناة مايكرو ( الأحمر ) و ( الأصفر ) إنتاج اللاكتات نازعة ( LDH ) . ( ب ) توازن تركيز الجلوكوز في مسار التدفق ( الأحمر ) في 2-oc وفي تجويف الأنبوب القريب ( الأصفر ) . الخطوط المنقطة تمثل تركيز الجلوكوز الأولي في المتوسط يوميا إضافة إلى الكبد ( الأحمر ) و ( الأصفر ) القريبة من تجويف أنبوبي . ( ج ) قياس النشاط الأيضي للثقافة المشتركة بقياس إنتاج حامض اللبنيك واستهلاك الجلوكوز في وسائل الإعلام المتداولة .

نحن نستخدم استهلاك الجلوكوز و إنتاج حمض اللاكتيك في microchannel كمؤشر لتقييم النشاط الأيضي المشارك ثقافة النظام ( الشكل 3 ) . النشاط الأيضي 2-oc النظام يظهر منحنى ثنائي الطور ، في أول يومين من دون إدارة النشاط الأيضي استمرت في الانخفاض ، ولكن من اليوم صفر ، النشاط الأيضي في حالة مستقرة ، تذبذب طفيف . انخفاض طفيف في إنتاج حمض اللاكتيك قد تشير إلى وجود تأثير شرطي بين الكبة و القريبة من الحاجز .

كل من النشاط الخلوي والتمثيل الغذائي المنحنيات أظهرت أن 2-oc النظام يمكن أن تبقي على حيوية مميزة وظيفة الكبد والكلى الأجهزة مثقف لمدة 16 يوما . هذه المواد يمكن أن تستخدم في التجارب اللاحقة من خلال إنشاء سلسلة المشارك ثقافة النظام مع ارتفاع التكرار والاستقرار .

نموذج من أربعة عشر يوما جرعة زائدة من التعرض للأدوية على أساس نظام ميكروأري جنبا إلى جنب زراعة الكبد والكلى :باستخدام وكالة الفضاء الكندية أو وكالة الفضاء الكندية جنبا إلى جنب مع طلب تقديم العروض ، ميكروأري المستندة إلى نموذج الكبد والكلى ثقافة المشارك وكالة الفضاء الكندية ( الشكل 4 ألف ) أو طلب تقديم العروض ( الشكل 4 باء ) تم قياس تركيزات في اليوم الأول ( اليوم الأول ) و اليوم الأخير ( اليوم الرابع عشر ) و 24 ساعة بعد اليوم الأول ( اليوم السابع ) من الجمع بين الإدارة . كما هو مبين في الشكل 4 جيم ، وكالة الفضاء الكندية التعرض في قناة مايكرو المسار زاد مع زيادة الجرعة من 5 أمتار إلى 20 أمتار في اليوم الأول ، 7 و 14 يوما بعد الإدارة . مستويات وكالة الفضاء الكندية في 24 ساعة بعد سبعة أيام من الإدارة المستمرة كانت أقل من تلك التي في أول وآخر إدارة . تركيز وكالة الفضاء الكندية في ميكروتشانيلس المسار انخفض عند 20 umcsa و 25umrfp تدار بشكل كامل بعد الجمع بين الأولى والأخيرة . وفي الوقت نفسه ، انخفض تركيز وكالة الفضاء الكندية بعد 8 أيام من طلب تقديم العروض . وفي الوقت نفسه ، بعد 8 أيام من الجمع بين الإدارة اليومية ، طلب تقديم العروض زيادة التركيز ( الشكل 4 ) ، مما يدل على أن طلب تقديم العروض المتراكمة في ميكروتشانيلس المسار . من أجل تقييم تأثير المواد السامة على الكبد والكلى الأجهزة ، ونحن فحص اللاكتات نازعة ( LDH ) الإصدار . LDH ، موثوق بها العلامات البيولوجية لتقييم السمية الكلوية في المختبر ، تم الكشف عنها في اثنين من وسائل الإعلام . في 1 و 7 و 14 يوما ، مع زيادة تركيز السيكلوسبورين أ ( وكالة الفضاء الكندية ) ، ورابطة حقوق الإنسان في تركيز متناهية يزيد تدريجيا ( الشكل 5 ) . LDH المستويات في مجرى الدم من 20um وكالة الفضاء الكندية انخفضت بعد الجمع بين 25um RFP لمدة 8 أيام متتالية ، وهو ما يتسق مع تركيز وكالة الفضاء الكندية في ميكروتشانيلس الطريق . ومع ذلك ،شو سيهذا الانخفاض لم يلاحظ بعد الجمع بين الإدارة ( الشكل 5 ) . في نهاية التجربة ، التعبير عن الجين p53 في الجمع بين العلاج المجموعة 1.5 مرة أعلى من السيطرة على المجموعة ، في حين أن التعبير عن Ki67 لم يتغير ( الشكل 5 باء ، جيم ) . ومع ذلك ، فإن الإفراج عن إضغط في تجويف الإفراز أظهرت زيادة حادة ولكن ليس كبيرا ( الشكل 5 ) .شو سيبعد الجمع بين الإدارة ، مستويات IDH استمرت في الارتفاع في اليوم السابع مقارنة مع مجموعة التحكم ( الشكل 5 ) . ومع ذلك ، يمكن ملاحظة انخفاض حاد في مستويات LDH بعد استخدام RFP8 في وقت واحد ( الشكل 5 ) . وعلاوة على ذلك ، فإن التعبير عن الجين p53 في الأجهزة الكلوية تعامل مع جرعة عالية من وكالة الفضاء الكندية بنسبة 2-3 مرات مقارنة مع تلك التي في السيطرة على الخلايا ( الشكل 5 ، ي ) . وفي الوقت نفسه ، وكالة الفضاء الكندية ، طلب تقديم العروض ، والتعبير عن الجينات Ki67 بنسبة 2.7 مرات ، في حين أن التعبير عن الجينات Ki67 انخفضت بشكل ملحوظ في جرعة منخفضة وعالية جرعة المجموعات في نهاية التجربة ( الشكل 5 ، ي ) . كما هو مبين في الشكل 5 d-g تونل / Ki67 / دات تلطيخ الثلاثي أظهرت زيادة في موت الخلايا الناجم عن التعرض وكالة الفضاء الكندية ، في حين أن التخفيف من موت الخلايا في الكبد cavernous جنبا إلى جنب مع وكالة الفضاء الكندية طلب العروض لوحظ . الخلايا المتكاثرة التي لوحظت مع Ki67 تلطيخ إيجابية موزعة بالتساوي في الكبة و تبقى في رقاقة ، لا يوجد فرق كبير بين مجموعات العلاج ( الشكل 5 d-g ) .

البروتين التعبير التقليدية والجديدة غير الغازية المؤشرات الحيوية السامة :من أجل استكشاف المزيد من التطبيقات من وزارة التجارة منصة في الكشف المبكر والتشخيص من الجهاز محددة السمية ، ونحن الكشف عن المؤشرات الحيوية التقليدية والجديدة التي تمت الموافقة عليها في الممارسة السريرية لتحديد المخدرات التي يسببها تلف الكبد والكلى في هذه التجربة . وترد في الجدول 3 معلومات عن التغيرات في مستويات المؤشرات الحيوية .

الشكل 4 - تحديد وكالة الفضاء الكندية و طلب تقديم العروض بعد الإدارة اليومية أو الجمع بين الإدارة و أيض الكبد والكلى الأجهزة في 2-oc . . . . . . . ( أ ) قياس الطيف الكتلي لوكالة الفضاء الكندية في وسائل الإعلام المتداولة . السهم يمثل قمة مميزة وكالة الفضاء الكندية . ( ب ) قياس الطيف الكتلي لعروض العروض في وسائل الإعلام المتداولة . السهم يمثل قمة مميزة من العروض . ( ج ) تركيز وكالة الفضاء الكندية في وسائل الإعلام المتداولة ، والتمثيل الغذائي للكبد والكلى في 2-oc أيام 1 و 7 و 14 بعد تكرار الإدارة اليومية . ( د ) تركيز طلب تقديم العروض في تداول وسائل الإعلام بعد تكرار الإدارة اليومية ، والتمثيل الغذائي في الكبد والكلى الأجهزة في 2-oc أيام 7 و 14 . التجارب التي أجريت ثلاث مرات في السيطرة على المجموعة و جرعة منخفضة من المجموعة ، على التوالي ، في حين أن التجارب التي أجريت أربع مرات في الجرعات العالية و الجمع بين إدارة المجموعة . * * * * * * * * * * * * * * أو * * * * * * * * * * * * * * يدل على فرق كبير بين ع القيم أقل من 0.05 أو 0.01 ، على التوالي . * أو التابيوكا ، على التوالي ، تمثل الفرق بين الجرعات العالية والسيطرة على المجموعة .

المؤشرات الحيوية في ميكروتشانيلس الطريق ( الشكل 6 ) ، الكبد انزيم است زيادة في الجرعة التي تعتمد على مستوى است في الجمع بين مجموعة العلاج في نقطة النهاية بدلا من طلب تقديم العروض .شو CI انخفض بعد العلاج . ألب زيادة كبيرة في اليوم الرابع عشر فقط بعد العلاج وكالة الفضاء الكندية ، في حين أن استخدام طلب تقديم العروض في نفس الوقت يقلل من مستوى ألب في 20um وكالة الفضاء الكندية . زيادة كبيرة في tbii لوحظ فقط في مرحلة ما بعد طلب العروض . انخفاض الجلوكوز في ميكروتشانيلس تعتمد على الجرعة ، وهذه الجزيئات قد وصلت إلى مستويات ذات دلالة إحصائية في كل من 7 و 14 يوم جرعة عالية من العلاج . بعد 20 UM وكالة الفضاء الكندية و طلب تقديم العروض ، تركيز الجلوكوز في الدم البديل حلقة زيادة في الجمع بين إدارة المرحلة . المؤشرات الحيوية في الدم الكلوي البديل ، لجنة المساواة العرقية ، أوريا ، زادت في اليوم الأول ، ولكن لم يلاحظ أي تغيير في المخدرات ذات الصلة في 7 و 14 يوما . مستويات أب ، GGT ، لاك لم تتغير مع وكالة الفضاء الكندية .

المؤشرات الحيوية في نظام الإفراز : في إفراز وسائل الإعلام ( انظر الشكل 7 ) ، GGT ( γ - glutamyltransferase ) مستويات أظهرت زيادة الجرعة تعتمد في اليوم الأول . ومع ذلك ، بعد سبع دورات متتالية من وكالة الفضاء الكندية ، GGT المستويات في الجرعات العالية المجموعة انخفضت بشكل ملحوظ ، و تأثير مماثل لوحظ في اليوم الرابع عشر . العلاج المتزامن مع طلب تقديم العروض لم تسفر عن انخفاض في مستويات GGT في 7 و 14 يوما . وينطبق الشيء نفسه على القريبة من الحاجز الأنبوبي في جميع مجموعات العلاج .

fig.5 . سمية CSA14 يوميا أو في وقت واحد في الكبد والكلى جنبا إلى جنب الجهاز ميكروأري . ( أ ) LDH النشاط في الدم البديل متوسطة في 1 و 7 و 14 يوما . التعبير عن ( ب ) البروتين p53 ( ج ) ki6 الجينات في الكبد لمبة تم تحليلها من قبل qrt-pcr . . . . . . . في نهاية التجربة ، تونل / Ki67 ( الأخضر / الأحمر ) تلطيخ الخلايا الكبدية الكروية في ( د ) السيطرة على المجموعة ( هـ ) جرعة منخفضة من المجموعة ( و ) جرعة عالية من المجموعة ( ز ) الجمع بين العلاج . ( ح ) نشاط إضغط في إفراز وسائل الإعلام في الأيام 1 و 7 و 14 . في نهاية التجربة ، qrt-pcr تحليل البروتين p53 ( ط ) و ( ي ) Ki67 التعبير الجيني في الأنابيب القريبة الحاجز . وكانت البيانات الرئيسية ± الانحراف المعياري ، ثلاث مرات في السيطرة على المجموعة و جرعة منخفضة من المجموعة ، على التوالي ، أربع مرات في جرعة عالية من المجموعة و المجموعة . * * * * * * * * * * * * * * أو * * * * * * * * * * * * * * يدل على فرق كبير بين ع القيم أقل من 0.05 أو 0.01 ، على التوالي . * أو التابيوكا ، على التوالي ، تمثل الفرق بين الجرعات العالية والسيطرة على المجموعة .

مع زيادة جرعة من وكالة الفضاء الكندية ، تذمر الانزيمات في البول أيضا تفرز . وكالة الفضاء الكندية و طلب تقديم العروض لها تأثير مماثل على ألب في إفراز داخلي . في إطار العمل من وكالة الفضاء الكندية ، الجلوكوز انخفض بشكل كبير في الجرعة التي تعتمد على مستوى السكر في الجمع بين مجموعة العلاج كان أقل من وكالة الفضاء الكندية مجموعة العلاج . بعد العلاج مع وكالة الفضاء الكندية ، لاك تركيز زيادة كبيرة ، في حين أن طلب تقديم العروض يقلل من تأثير وكالة الفضاء الكندية على لاك إفراز .

الشكل 6 - التعبير عن البروتين غير الغازية المؤشرات الحيوية في قناة مايكرو المسار بعد 14 يوما من استخدام وكالة الفضاء الكندية وحدها أو في وقت واحد في الكبد والكلى جنبا إلى جنب الثقافة ميكروأري . مستويات البروتين ( أ ) است ( ب ) ألب ( ج ) tbil ( د ) غلوكوز ( هـ ) نموذج الإبلاغ الموحد ( و ) أوريا ( ز ) AIB ( ح ) CGT ( ط ) في 1 و 7 و 14 يوما من التداول . وكانت البيانات الرئيسية ± الانحراف المعياري ، ثلاث مرات في السيطرة على المجموعة و جرعة منخفضة من المجموعة ، على التوالي ، أربع مرات في جرعة عالية من المجموعة و المجموعة . * * * * * * * * * * * * * * أو * * * * * * * * * * * * * * يدل على فرق كبير بين ع القيم أقل من 0.05 أو 0.01 ، على التوالي . * أو التابيوكا ، على التوالي ، تمثل الفرق بين الجرعات العالية والسيطرة على المجموعة .
kim-1 ، الكلى محددة العلامات البيولوجية التي تم تحديدها رسميا من قبل المنظمين ، زيادة الجرعة طوال فترة الدراسة ، وكالة الفضاء الكندية بوساطة زيادة km-1 انخفض مع مرور الوقت ، وكذلك عندما طلب تقديم العروض . نتائج مماثلة في cysc و كولي Ⅳ المستويات في إفراز وسائل الإعلام . ومع ذلك ، في مرحلة ما بعد طلب تقديم العروض ، طلب تقديم العروض سوف تعزز دور العقيد الرابع . بعد العلاج مع وكالة الفضاء الكندية ، تركيزات كلو و نكال زيادة كبيرة ، في حين أن العروض انخفضت مستويات كلو و نكال بشكل ملحوظ . وبالإضافة إلى ذلك ، في منتصف مرحلة الدراسة ، إفراز هذه العلامات البيولوجية قد وصلت إلى مستوى عال من زوي أثناء التجربة ، مستوى إفراز الزراعة العضوية كانت مستمرة ، في حين أن مستوى الزراعة العضوية في جرعة عالية من المجموعة ظلت مرتفعة . انخفاض في الزراعة العضوية في الجمع بين مجموعة كبيرة من التأخير . وبالمثل ، ip-10 زادت بعد 20 أوم وكالة الفضاء الكندية ، في حين أن طلب تقديم العروض انخفض قليلا في ip-10 الملاك 14 . وكالة الفضاء الكندية التي يسببها زيادة الجرعة تعتمد على مستويات gst-a الزلال لوحظ فقط في اليوم الأول . وكالة الفضاء الكندية زيادة fabp-1 ، في حين أن الانخفاض في إنتاج طلب تقديم العروض في وقت واحد لم يلاحظ حتى وقت لاحق ( 14 يوما ) ، في حين أن رينيه و a1-mg شهدت تغييرات مماثلة في 7 و 14 يوما . في اليوم الأول ، وكالة الفضاء الكندية يمكن أن يسبب زيادة في أوبن ، ولكن ليس مع الجرعة ، في اليوم السابع ، زيادة في أوبن يرتبط مع الجرعة . على الرغم من أن تأثير وكالة الفضاء الكندية على أوبن اختفى في اليوم الرابع عشر ، انخفاض كبير في الطلب الناجم عن أوبن تم الحفاظ عليها في مرحلة لاحقة من طلب تقديم العروض . timp-1 أظهرت زيادة كبيرة في الاعتماد على الجرعة في اليوم الأول . ومع ذلك ، فإن تأثير وكالة الفضاء الكندية على timp-1 انعكس في 7 و 14 يوما . في مرحلة ما بعد طلب تقديم العروض ، وكالة الفضاء الكندية إلى زيادة مستوى timp-1 انخفض إلى حد ما . إذا كان العلاج مع وكالة الفضاء الكندية أو طلب تقديم العروض في وقت واحد ، قد يكون هناك انخفاض في الجرعة التي تعتمد على . المخدرات ذات الصلة التغييرات لم يلاحظ في caib و tff-3 ( البيانات لم تظهر ) .

الشكل 7 - التعبير عن البروتين غير الغازية العلامات البيولوجية السامة في تجويف الإفراز بعد 14 يوما من استخدام وكالة الفضاء الكندية وحدها أو في وقت واحد في الكبد والكلى جنبا إلى جنب الثقافة ميكروأري . ( أ ) CGT ( ب ) ALP ( ج ) تذمر ( د ) الجلوكوز ( هـ ) اللاكتات ( و ) kim-1 ( ز ) سيستاتين ج مستويات البروتين ( ح ) الكولاجين Ⅳ ( ط ) راصة ( ي ) نكال ( ك ) osteoactivin ( ل ) ip-10 ( م ) gst-a ( ن ) الزلال ( س ) fabp-1 ( ع ) الرينين ( س ) α 1-microglobulin ( ص ) إفراز عامل نمو العظام ( ر ) في اليوم الثامن عشر و اليوم السابع عشر و اليوم السابع عشر في المتوسط ( ت ) . وكانت البيانات يعني ± SEM ، ثلاث مرات في السيطرة على المجموعة و جرعة منخفضة من المجموعة ، على التوالي ، أربع مرات في جرعة عالية من المجموعة و المجموعة . * * * * * * * * * * * * * * أو * * * * * * * * * * * * * * يدل على فرق كبير بين ع القيم أقل من 0.05 أو 0.01 ، على التوالي . * أو التابيوكا ، على التوالي ، تمثل الفرق بين الجرعات العالية والسيطرة على المجموعة .

التغيرات في التعبير الجيني الإنزيمات الأيضية و الناقلين : في هذه الدراسة ، ونحن مواصلة دراسة الإنزيمات الوظيفية و الناقلين في فئتين من الأجهزة ودورها في إزالة السموم أو التسمم ( الشكل 8 ) . في نهاية التجربة ، التعبير عن mrp-2 في الكبد والكلى الأجهزة الناجمة عن طلب تقديم العروض . التعبير عن الجينات في كبد PGP كروي زيادة طفيفة بعد الإدارة في وقت واحد مع طلب العروض . وعلى النقيض من ذلك ، p-gp التعبير الجيني في rptec / tert1 الخلايا يمكن أن يسببها استخدام السيكلوسبورين أ ( وكالة الفضاء الكندية ) بشكل كبير ، في حين أن p-gp التعبير الجيني لا يمكن ملاحظتها في الجمع بين العلاج .

الشكل 8 - التعبير الجيني الإنزيمات الأيضية و الناقلين في الكبة و القريبة من الحاجز الأنبوبي بعد 14 يوما من طلب تقديم العروض وحدها أو في وقت واحد في كل يوم في الكبد والكلى جنبا إلى جنب coculture ميكروأري . في نهاية التجربة ، التعبير مرنا في الكبد ( أ ) mrp-2 ( ج ) pgp ( هـ ) cyp3a4 ( و ) bsep والكلى ( ب ) mrp-2 ( د ) p-gp مطوية بالمقارنة مع مجموعة المراقبة . البيانات يعني ± الانحراف المعياري ، ثلاث مرات في السيطرة على المجموعة و جرعة منخفضة من المجموعة ، على التوالي ، أربع مرات في جرعة عالية من المجموعة و المجموعة . * * * * * * * * * * * * * * أو * * * * * * * * * * * * * * يدل على فرق كبير بين ع القيم أقل من 0.05 أو 0.01 ، على التوالي . * أو التابيوكا ، على التوالي ، تمثل الفرق بين الجرعات العالية والسيطرة على المجموعة .

التعبير عن cyp3a4 و bsep لوحظ في وكالة الفضاء الكندية مجموعة العلاج و الجرعة التي تعتمد على الانخفاض . التأثير التثبيطي وكالة الفضاء الكندية على bsep انخفض قليلا بسبب إدارة RHP في نفس الوقت ، ولكن ليس هناك فرق كبير في cyp3a4 بين وكالة الفضاء الكندية مجموعة و مجموعة العلاج في نفس الوقت .

مناقشة

أحدث الأبحاث تشير إلى أن الجهاز مثل رقاقة التكنولوجيا يمكن إعادة بناء ثلاثي الأبعاد ( 3D ) المكروية ، محاكاة هيكل ، والميكانيكا ، وعلم وظائف الأعضاء والتمثيل الغذائي خصائص الأجهزة والأنسجة البشرية . على سبيل المثال ، نماذج من الأجهزة الكبدية التي أنشئت باستخدام تقنيات ثلاثية الأبعاد تظهر زيادة وظائف الكبد ، لا سيما عندما nonparenchymal الخلايا المتكاملة في الأجهزة . وقد وضعنا مستقرة ومتكررة تجميع نظام تمايز الأجهزة الكبدية ، بما في ذلك heparg ( متني ) و ( hhstec nonparenchymal ) الخلايا التي يمكن أن تتكاثر فصيص هيكل ، وحدة وظيفية من الكبد . heparg خط الخلية يستخدم نموذج للتنبؤ تحريض المخدرات على الإنسان السيتوكروم P450 ( P450 ) الانزيمات في المختبر . وبالإضافة إلى ذلك ، محاكاة السوائل إجهاد القص و الضغط الخلالي حول الكبد مثل الأجهزة يساعد على الحفاظ على استقرار المكروية على أساس البروتين والأكسجين التدرج لفترة طويلة في رقاقة . وعلاوة على ذلك ، فإن التعبير عن البروتينات ذات الصلة ، بما في ذلك zo-1 و claudin-10 ، يشير إلى أن مفرق ضيق العامة خلية قطبية من الحاجز في الخلايا أنبوبي القريبة تم الحفاظ عليها طوال coculture . . . . . . .

قياس الكرياتينين في الدم ( CRE ) واليوريا ( أوريا ) قد استخدمت لفترة طويلة في تشخيص وكالة الفضاء الكندية التي يسببها الكلوي . ومع ذلك ، كما لوحظ في هذه الدراسة ، هذه المؤشرات الحيوية لا تظهر إفراز لفترة طويلة ، وبالتالي فهي غير حساسة وغير كافية . rptec / tert1 خطوط الخلايا البشرية أثبتت أن تكون قادرة على استقطاب لتشكيل طبقة واحدة كثيفة ، والتعبير عن الإنزيمات والبروتينات في أنسجة معينة لفترة طويلة ، لذلك تم إنشاء نموذج لتقييم سلامة الدواء في المختبر . على المدى الطويل الفسيولوجية والجزيئية الاتصالات بين اثنين من الأجهزة و الغرف التي تم نسخها من قبل رقاقة المستندة إلى نموذج المشارك ثقافة الكبد القريبة من الأنابيب الملتوية . العديد من المؤشرات الحيوية ، مثل kim-1 CLU , الزراعة العضوية , و NGAL ، وأعرب عن cocultured ميكروأري ، والتي يمكن استخدامها لتقييم السمية على المدى الطويل ، لمحاكاة رد فعل الجسم على التعرض الكلوي . . . . . . . ادارة الاغذية والعقاقير EMEA قد وافقت على ثمانية غير الغازية المؤشرات الحيوية إصابة الكلى التي وصفت بشكل كاف في الجسم ويمكن الكشف عنها في البول أو الدم من الحيوانات أو البشر . من بين ثمانية مؤهلين المؤشرات الحيوية ، KIM-1、 الزلال ، كلو و tff-3 تعتبر علامات المرتبطة تنكس أنبوبي حاد .

تمشيا مع الدراسات السابقة ، وغيرها من العلامات التي تتفاعل مع وكالة الفضاء الكندية التي يسببها الكلوي الحاد ، بما في ذلك ضريبة السلع والخدمات - α ، نكال ، أوبن ، GGT ، تذمر و timp-1 في إفراز وسائل الإعلام ، فضلا عن لجنة المساواة العرقية ، أوريا في الدم البديل ، يمكن تصنيفها على أنها علامات بيولوجية أنبوبي كلوي الضرر . وقد أظهرت الدراسات أن الزراعة العضوية التنظيم يرتبط مع إصابة الكلى الحاد الظهارية أنبوبي ، بما في ذلك وكالة الفضاء الكندية التي يسببها الضرر والتليف الخلالي أنبوبي في الجسم الحي . زيادة الجرعة التي تعتمد على الزراعة العضوية يدعم الاستنتاج بأن الزراعة العضوية يمكن أن تصنف على أنها حساسة العلامات البيولوجية في وقت مبكر من الإصابة . α - 1-mg البول ، التي تنتج أساسا في الكبد ، قد ترتفع في كل من الأنابيب الصغيرة والكبيرة الإصابات . الكبد محددة ( fabp-1 fabp-1 ) أعرب في الأنابيب الملتوية القريبة . . . . . . . هذه الجزيئات هي المؤشرات الحيوية الحادة ، ولا سيما الإصابات الكلوية المزمنة ، وبالتالي فإن هذه النتائج يمكن أن تفسر جزئيا زيادة مستويات fabp-1 و طوال فترة الدراسة ، جرعة عالية من وكالة الفضاء الكندية حتى ينظم كول الرابع . وبالإضافة إلى ذلك ، كول الرابع عن الغشاء القاعدي للأنابيب الكلوية . وهكذا ، حتى تنظيم كول الرابع في coadministration المجموعة إلى تجديد الخلايا الظهارية الكلوية الناجمة عن التعبير الجيني في 14 يوما Ki67 . . . . . . . كالب موجود في الأمعاء الدقيقة و قمعها في نهاية بكثير من الأنابيب الكلوية بعد استخدام وكالة الفضاء الكندية على المدى الطويل . ولذلك ، كالب ، المؤشرات الحيوية في المختبر والمجراة في إصابة أنبوبي كلوي ، يستجيب إلى وكالة الفضاء الكندية واحدة وتكرار العلاج لا علاقة له مع المخدرات . هذاشو كاريتاس الدولية تقارير تقييم مجموعة من المؤهلين والمحتملين noninvasive الكلوي المؤشرات الحيوية على ميكروفلويديك منصة وزارة التجارة ، مما يدل على قدرة ومزايا وزارة التجارة في الفرز الفائق الإنتاجية في وقت مبكر من تطوير الأدوية .
حاجز الأمعاء الكبيبي المكافئات سيتم دمجها في نظام جديد وزارة التجارة ، على سبيل المثال ، أربعة أجهزة رقاقة ، من أجل تحسين وتحسين أبحاثنا . من ناحية ، انخفاض التوافر البيولوجي وكالة الفضاء الكندية ينبغي النظر فيها . انخفاض التوافر البيولوجي وكالة الفضاء الكندية يرجع أساسا إلى عملية التمثيل الغذائي في الكبد ، ويرجع ذلك جزئيا إلى امتصاص الأمعاء . انخفاض التوافر البيولوجي قد يكون أوضح من خلال تحريض CYP450 في الأمعاء ، والتي هي أكبر بكثير من الكبد الأيض . تأثير وكالة الفضاء الكندية على الأمعاء والكبد الدورة الدموية في الجسم الحي هو محاكاة على وزارة التجارة منصة .
خاتمة
في هذه الدراسة ، ونحن تقييم microfluidic multiorgan رقاقة منصة تمكن من تكرار و تعريف محدد للكبد والكلى أنبوبي القريبة الحاجز في غضون 16 يوما من خلال ربط وسائل الإعلام حلقة ، كل منها 100 ، 000 مرات أصغر من نظيراتها البشرية . وبالإضافة إلى ذلك ، فإن نسبة السوائل والأنسجة مصممة في أجهزة ميكروفلويديك و 2-oc نموذج يدعم التواصل الكافي بين الأجهزة . وأخيرا ، cocultured الأنسجة المعادل عن علامات محددة ، والأنزيمات ، والنقل ، ويمكن الطعن من قبل وكالة الفضاء الكندية مع الكبد والكلى سمية ، والتي يمكن أن تخفف من خلال الكبد المخدرات الاستقلاب محفز طلب العروض . في الوقت الحاضر ، منصة تعتمد على رقاقة ميكروفلويديك هو مناسبة لأنّ حجم الأنسجة و زراعة الأنسجة موحدة الشكل .

المواد والأساليب

تصميم وتصنيع رقائق الجهاز الثنائي :المتاحة تجاريا microphysiological ثنائي رقاقة 2-oc متكاملة من قبل اثنين من 96 خلية ثقافة المكونات الإضافية . 2-oc المصنعة من قبل tissuse GmbH كما وصفها واجنر et al . تدفق السوائل في الدائرة هي التي شيدت من قبل نبض مضخة صغيرة على رقاقة وفقا وو et al . مضخة صغيرة على رقاقة يقودها الهواء المضغوط من وحدة التحكم الخارجية المقدمة من تيسوس GmbH .

مصادر الخلايا البشرية :إن heparg خط الخلية البشرية و rptec / tert1 ( crl-4031 ) تم شراؤها من ATCC ( ATCC ) في ماناساس ، فرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية . hhstec خط الخلية تم شراؤها من مختبر أبحاث الخلية العلمية في كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية .

زراعة الكبدheparg الخلايا المستزرعة في heparg متوسطة ( بما في ذلك 10 ٪ مصل بقري جنيني ( FBS ، تكنولوجيا الحياة ، سيدني ، نيو ساوث ويلز ، أستراليا ) ، 2 ملم glutamax ، 10 ، 000 ش / مل البنسلين ، 10 ، 000 ميكروغرام / مل الستربتوميسين ، 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين البشري ( سيغما الدريتش ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية ) و 5 × 10-5-hydroxysuccinate إدارة الغذاء والدواء في الصين ) . كل خلية متوسطة و المكملات الغذائية التي تم شراؤها من تكنولوجيا الحياة ( كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ) . heparg الخلايا المستزرعة في 37 درجة مئوية و 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون ، وسائل الإعلام تتغير كل يوم . الخلايا المستزرعة في heparg متوسطة لمدة أسبوعين للحث على تمايز الخلايا heparg . . . . . . . ثم تم إضافة 2 ٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد ( DMSO ) ؛ سيغما الدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية ) لمدة أسبوعين . hhstec الخلايا التي تم شراؤها من الخلايا النجمية في المختبر العلمي في كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية . الخلايا التي تم حصادها من أجل مزيد من coculture عندما وصلت إلى 80 في المائة .

تشكيل كبد الإنسان المجال كما وصفها واجنر et al . ببساطة ، 50 μ ل تعليق خلية تحتوي على 0.1 × 104hhstec و 2.4 × 104 خلايا heparg ( كورنينج كوستار ، الولايات المتحدة الأمريكية ، kennabank ) وضعت في كل من 384 الثقوب . الخلايا المستزرعة على شاكر في حاضنة غاز ثاني أكسيد الكربون لمدة 3 أيام على شكل كرات مستديرة مدمجة . ثم يتم نقل المجال إلى التصاق منخفضة جدا 24 فتحة لوحة ( كورنينج كوستا ، الولايات المتحدة الأمريكية ) . 40 - المجالات التي تم جمعها على شكل واحد الكبد معادلة 2-oc النظام . مورفولوجيا الخلايا الكبدية heparg متباينة تم تقييمها من قبل إيفوس XL الأساسية المجهر المقلوب ( الحياة والتكنولوجيا ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ) .

إنشاء نموذج حاجز أنبوبي القريبة :rptec / tert1 الخلايا المستزرعة في dmem و ham ' s-f-12 متوسطة مع 2 ملم glutamax ، 10 ، 000 ش / مل البنسلين ، 10 ، 000 ميكروغرام / مل الستربتوميسين ، 36 نانوغرام / مل الهيدروكورتيزون ، 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين البشري ، 5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين ، 5 نانوغرام / مل من الصوديوم ( 1 × ) ، 10 نانوغرام / مل من عامل نمو البشرة ( hegf ) . وسائل الإعلام والمكملات الغذائية التي تم شراؤها من تكنولوجيا الحياة في كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية . الهيدروكورتيزون تم شراؤها من سيغما الدريتش في سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية .
كل transwell permeable سقالة زرع 100 ، 000 rptec / tert1 الخلايا والسماح لهم التمسك بها في الليل . ثم ، متوسطة الثقافة من الغرفة العليا هو استبدال لإزالة الخلايا غير الملتصقة . قبل التجربة ، زرع دعامات كانت تزرع في 2-oc لمدة 4 أيام و 3 أيام تحت الري . في 2-oc ، إدراج الفيلم هو وضعه في موقف 100 أمي فوق الجزء السفلي من غرفة الثقافة لضمان حرية مرور وسائل الإعلام تحت الحاجز القريب من الأنابيب الملتوية . مورفولوجيا وتمايز الخلايا RPTEC / tert1 تم رصدها من قبل إيفوس XL الأساسية المجهر المقلوب .

شارك في الثقافة على أساس رقاقة :أربعة عشر 2-oc النظم المستخدمة في التجربة ، التي كانت تزرع في 500 ميكرولتر تداول متوسطة ، و 100 ميكرولتر متوسطة أضيفت إلى أعلى من الحاجز المكونات . وسائل الإعلام في خزان الصرف الصحي يتم استبدالها يوميا . نصف حلقة طاف يتم استبدالها وجمعها . في نهاية 16 يوما من coculture ، وظيفة محددة علامات الكبد أو ما يعادلها تم تحليلها من قبل الجهاز المناعي و qrt-pcr . . . . . . . مضخة صغيرة على رقاقة مجموعة تردد 0.8 هرتز ، مما أسفر عن معدل تدفق لا يتجاوز 9 ميكرولتر / دقيقة .

الكواشف التجريبيةوكالة الفضاء الكندية ( كاس رقم 59865-13-3 ) أضيفت إلى تكرار الجرعات coculture لاختبار . طلب تقديم العروض ( كاس رقم 13292-46-1 ) تدار في وقت واحد مع وكالة الفضاء الكندية . أما بالنسبة للسوائل الاحتياطية ، وكالة الفضاء الكندية ، طلب تقديم العروض ( ادارة الاغذية والعقاقير - بكين ) يذوب في DMSO وتخزينها في مكان مظلم في 4 درجة مئوية ، المخفف إلى 0.1 في المائة من تركيز DMSO النهائي عند استخدامها .

المخدرات المعرضة للكبد والكلى المشارك رقاقة الثقافة :بعد ثلاثة أيام من coculture دون التكيف مع المخدرات ، وكالة الفضاء الكندية مخففة إلى متوسطة جديدة مع تركيز 10 ميكرومتر ( جرعة منخفضة ) و 20 ميكرومتر ( جرعة عالية ) و تدار يوميا لمدة 13 يوما . وفي المجموعة المشتركة ، أعطيت 20 ميكروغرام من وكالة الفضاء الكندية يومياً حتى اليوم السادس ثم 20 ميكروغرام من وكالة الفضاء الكندية و 25 ميكروغرام من طلب تقديم العروض يومياً من اليوم السادس إلى اليوم الثالث عشر . متوسطة تحتوي على 0.1 في المائة DMSO استخدمت في السيطرة على الثقافة ( انظر الشكل 1 جيم ) .

شارك في تحليل الثقافة :supernatants : نشاط الخلايا رصدها يوميا قياس اللاكتات نازعة ( LDH ) النشاط في supernatants في الكبد و الحاجز بين الأنابيب المنحنية القريبة . النشاط الأيضي يقاس باستخدام حمض اللاكتيك اللونية عدة ( biovision ، ميلبيتاس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ) لقياس مستويات الجلوكوز حمض اللاكتيك في اثنين من مقصورة supernatants يوميا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة . تركيزات وكالة الفضاء الكندية و طلب تقديم العروض في الدورة الدموية تم تحليلها من قبل السائل اللوني وبالترادف مطياف الكتلة ( lc-ms / MS ) في 1 و 7 و 14 يوما . بما في ذلك LDH ، الجلوكوز ، أسبارتات أمينوترانسفيراز في المصل ( AST ) ، والفوسفاتيز القلوية ( ALP ) ، غاما glutamyltransferase ( GGT ) ، n-acetyl-beta-d-glucosaminidase ( تذمر ) ، البيليروبين الكلي ( tbil ) ، الزلال ( قلب ) ، الكرياتينين ( CRE ) واليوريا ( أوريا ) تم الكشف عنها باستخدام هيتاشي 7180 التلقائي محلل البيوكيميائية ( اليابان ) . تم شراء مجموعات العلامات المذكورة أعلاه من واكو ( اليابان ) . 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 ، 1 3 ( tff-3 ) ، عامل نمو البشرة ( لو ) و الزلال البولي تم قياسها باستخدام milliplex خريطة ميريك millipore ( بيلريكا ، ماساشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية ) . الاختبارات التي أجريت على luminex 200 ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية ، بناء على تعليمات من الشركة المصنعة . تم تحليل البيانات من خلال تحليل ميلبليكس 5-1 البرمجيات ( بيلريكا ، ماساشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية ) .

تحليل زراعة الأنسجة قبل وبعد الإدارة :الخلايا الكبدية و الأغشية التي تحتوي على rptec / tert1 الخلايا المجمدة في مجمع o.c.t . وتخزينها في - 80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل . من أجل تلطيخ ، شرائح ثابتة لمدة 10 دقائق مع الأسيتون - 20 درجة مئوية أو 4 ٪ منهاج العمل لمدة 10 دقائق . الخلايا ثم تعامل مع 0.05 ٪ تريتون x-100 ، وغسلها مع 10 ٪ من مصل الماعز لمدة 30 دقيقة ، ثم احتضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ° C أو لمدة 2 ساعة مع anti-cyp3a4 bsep , ck8 / 18 ، جواز سفر يقرأ إلكترونيا ، نا + ك + أتباز ، p-gp ، فيم ، zo-1 cldn , 10 , و ki67 ( جميع من ابكام ، كامبريدج ، ماساشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية ) . بعد ذلك ، شرائح غسلها ثلاث مرات و احتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة . dapi ( سيجما الدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية )
انتشار الخلايا تم تحليلها من قبل نفق / ki67 المناعي تلطيخ . وباختصار ، باستخدام تقنية النفق ( apoptag1 البيروكسيديز في الموقع موت الخلايا المبرمج كيت ) Merck Millipore, damstadt ، ألمانيا ) وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة للصباغة . dapi تلطيخ النووية المستخدمة . جميع الصور التي تم الحصول عليها باستخدام المجهر مضان نيكون الكسوف 80i الرقمية ( طوكيو ، اليابان ) أوليمبوس التاسع 71 مقلوب المجهر ( طوكيو ، اليابان ) جنبا إلى جنب مع صورة برو زائد البرمجيات ( الإصدار 6.0 ، وسائل الإعلام cybernetics Inc . ، ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية ) .
مجموع الحمض النووي الريبي المعزولة من الخلايا الكبدية الكروية و القريبة من الأنابيب الملتوية باستخدام rneasy @ مايكرو كيت ( QIAGEN ، دوسلدورف ، ألمانيا ) . كدنا التوليف باستخدام fastquant RT كيت ( بما في ذلك gdnase ) ( tiangen biotech ؛ بكين ، الصين ) . qrt-pcr التضخيم أجريت على خط جين 9620 نموذج ( fqd-96a بيور ) باستخدام سيبر الأخضر الكشف ( tiangen biotech ؛ بكين ، الصين ) . يتم تنفيذ البرنامج وفق تعليمات الشركة المصنعة للمجموعة والبرامج الواردة في الجهاز . تحليل البيانات باستخدام البرمجيات الإصدار 2.0.6 . التغيرات في مستوى مرنا يحددها 2 - Δ CT . التمهيدي تم شراؤها من قبل سانغون biotech ( بكين ، الصين ) . و β - أكتين TBP هي الجينات المشاركة في الكبة و القريبة من الحاجز . التمهيدي تسلسل الجينات المستهدفة المبينة في الجدول 1 من المواد التكميلية .

التحليل الإحصائيالتقييم الإحصائي يستخدم الرسم البياني prism ( الإصدار 6.0 ، سان دييغو ، كاليفورنيا ) SPSS ( الإصدار 17.0 ) ؛ IBM， أمونك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية ع قيمة تم الحصول عليها من خلال تحليل التباين الأحادي ، واختبار ( ت ) من الطلاب . وأجريت جميع التجارب ثلاث مرات مكررة ( مجموعة المراقبة ومجموعة الجرعات المنخفضة ) أو أربع مرات مكررة ( مجموعة الجرعات العالية والمجموعة المشتركة ) . ما لم ينص على خلاف ذلك ، جميع البيانات المقدمة في المتوسط ± الخطأ المعياري .

استلمت في: 18 نوفمبر 2019؛ قبلت: 15 أبريل 2020

نشر: 1 يونيو 2020